2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:探討外源性P21基因轉(zhuǎn)染對體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮(humanretinalpigmentepithelial,hRPE)細胞增殖的抑制作用及作用機制,為治療增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)提供新的基因治療思路。 方法:(1)以含有P21全長序列的質(zhì)粒pCEP-P21為模板PCR擴增P21cDNA,應(yīng)用基因重組技術(shù)與綠色熒光蛋白(GFP)基因融合,構(gòu)建以GFP為報告基因的重組表達質(zhì)粒pEGFP-P21,酶切及序列測定檢測

2、插入片段的正確性。(2)hRPE細胞原代和傳達培養(yǎng),傳至第三代時,通過細胞爬片,應(yīng)用抗人細胞角蛋白染色的免疫組織化學(xué)方法鑒定培養(yǎng)的細胞。(3)通過脂質(zhì)體介導(dǎo)將含GFP的重組表達質(zhì)粒pEGFP-P21轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的hPRE細胞。以轉(zhuǎn)染相同劑量空載體pEGFP-C1的孔為轉(zhuǎn)染對照組,以未作轉(zhuǎn)染的hRPE細胞為非轉(zhuǎn)染空白對照組。(4)在活細胞狀態(tài)下用熒光顯微鏡直接觀察pEGFP-P21融合蛋白在細胞中的分布和定位,并檢測其在轉(zhuǎn)染后6、12、2

3、4、48、72h的轉(zhuǎn)染效率;用Westernblot方法分析P21蛋白的表達。(5)轉(zhuǎn)染72h后應(yīng)用RT-PCR檢測各組RbmRNA的表達;Westernblot方法分析Rb蛋白的表達水平,并分析Rb蛋白的磷酸化情況。(6)免疫組化檢測轉(zhuǎn)染后72h各組PCNA(proliferatingcellnuclearantigen,增殖細胞核抗原)的表達情況;流式細胞技術(shù)分析細胞周期;細胞生長曲線、MTT法來檢測轉(zhuǎn)染后hRPE細胞的增生活性。

4、 結(jié)果:(1)酶切產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳時出現(xiàn)2條帶,大小分別為500bp和5Kb,與理論預(yù)計相符;重組質(zhì)粒中P21目的基因片段DNA序列及讀碼框架完全正確。酶切、DNA測序均證實插入片斷的正確性。(2)抗人細胞角蛋白染色的陽性率幾乎達100%,成功地在體外原代及傳代培養(yǎng)了hRPE細胞。(3)熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-C1對照組中,細胞內(nèi)綠色熒光呈彌散分布;轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-P21組中,綠色熒光在細胞胞漿胞

5、核內(nèi)都有表達,胞核內(nèi)表達明顯,呈強熒光顯示,與P21基因的表達一致;pEGFP-P21在轉(zhuǎn)染后6、12、24、48、72h的轉(zhuǎn)染率分別為3.65±0.88%、11.54±1.26%、26.27±1.39%、40.3±2.63%、32.9±1.86%。(4)Westemblot進一步證實了pEGFP-P21融合基因的表達:融合蛋白在50KD處出現(xiàn)陽性條帶,轉(zhuǎn)染對照組的GFP蛋白于29KD處出現(xiàn)陽性條帶,而空白對照組未出現(xiàn)特異條帶。(5)活

6、細胞計數(shù)生長曲線及MTT實驗結(jié)果可見,hRPE細胞在轉(zhuǎn)染pEGFP-P21后其增殖活性降低(P<0.01),生長曲線平緩;而轉(zhuǎn)染空載體組細胞和空白對照組細胞增殖活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。P21高表達明顯抑制hRPE細胞生長,于轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5、6d生長抑制率分別為14.3%、27.3%、33.3%、43.5%、45.1%和42.3%,且第5天抑制率最高。(6)細胞周期分析顯示,P21基因轉(zhuǎn)染細胞72小時后G1期和G0

7、細胞由49.65%增至78.63%,S期細胞和G2/M期細胞分別由33.64%減少至11.01%,16.53%減少至10.29%,表現(xiàn)為明顯的G0/G1期阻滯,差異有顯著性(P<0.01),但未見明顯的促調(diào)亡作用;轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-C1組與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(7)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72小時后,Westernblot檢測到各組都出現(xiàn)2條蛋白帶,1條代表高磷酸化Rb蛋白(115KD),另1條分子量較小的條帶為去磷酸化

8、Rb蛋白(105KD)??瞻讓φ战M和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對照組細胞的Rb蛋白主要以磷酸化形式存在,呈高度磷酸化狀態(tài)(去磷酸化為20%),二者無顯著差異(P>0.05),而轉(zhuǎn)染pEGFP-P21組的hRPE細胞所表達的Rb蛋白主要是去磷酸化Rb蛋白。同兩組對照組相比較,轉(zhuǎn)染pEGFP-P21組的去磷酸化比例增加為60%,磷酸化的Rb減少。(8)RT-PCR顯示轉(zhuǎn)染pEGFP-P21組RbmRNA表達量低于兩組對照組(P<0.05)。 結(jié)論:

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