Hox基因在高糖誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮細胞增殖分化中的作用研究.pdf

1、研究背景：
　　 隨著糖尿病發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)不斷上升，糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)已成為生后最常見的致盲原因之一。90％以上的糖尿病患者會導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變，其中約60％1型糖尿病患者、20％2型糖尿病患者最終會進展為增殖型糖尿病性視網(wǎng)膜病變[1](proliferative diabetic retinopathy,PDR)，PDR已然成為我國目前以及未來防盲、治盲的重點[2]。然而，鑒

2、于PDR的病理機制尚未完全闡明，且目前的治療方法-光凝和玻璃體切除術(shù)對局部組織創(chuàng)傷較大、遠期療效不明顯，在分子水平上探究其發(fā)病機制以期指導(dǎo)臨床顯得尤為重要。
　　 PDR是一類以新生血管形成為主要病理特征的細胞增殖性疾病，其發(fā)生發(fā)展與細胞的激活、增殖和分化調(diào)控失常有關(guān)，新生血管也是細胞異常增殖的結(jié)果。在決定細胞的定向分化與增殖的眾多基因中，Ⅰ型同源盒基因(Hox基因)是一類很重要的發(fā)育相關(guān)基因.一旦Hox基因或其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白功能

3、異常，將直接影響細胞的增殖與分化過程。已有研究表明Hox基因參與血管生成的過程，特別是在抗腫瘤血管生成的靶向治療中起到重要作用[3-8]；參與胚胎發(fā)育過程中肢體、器官等形態(tài)發(fā)生[9-11]。并且以種族特異性和階段特異性方式在造血增殖分化中起調(diào)控作用[12-14]等。目前Hox基因與糖尿病關(guān)系罕有報道[15,16]；其與PDR的關(guān)系，國內(nèi)外尚未見相關(guān)文獻報道。已有文獻證實高糖可使視網(wǎng)膜色素上皮細胞(retinal pigment epit

4、helium，RPE)發(fā)生一些增殖分化和功能方面的變化[17,18]，其中包括高糖致使RPE細胞分泌的細胞因子如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)和色素上皮衍生因子(pigment epithelium derivedfactor,PEDF)表達量的改變以及促進RPE細胞增生等。故我們設(shè)想在細胞增殖分化中起重要作用的Hox基因是否參與該變化過程?PDR是以新生血管為主要特征的

5、病變，而作為主要血管刺激因子的VEGF和主要血管抑制因子PEDF之間的平衡對新生血管的形成是至關(guān)重要的。有不少文獻報道了hox基因參與血管生成過程[19-24]，其中有部分文獻報道了某些Hox基因可分別參與VEGF和PEDF表達的調(diào)節(jié)[25,26]，我們又大膽設(shè)想Hox族基因是否能通過影響VEGF、PEDF的表達，參與視網(wǎng)膜新生血管形成過程進而與PDR的發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)?為驗證以上假設(shè)，我們設(shè)計如下實驗，進一步探討PDR的發(fā)病機理，以期在

6、分子水平上為其防治帶來新的曙光。
　　 目的：
　　 1觀察不同濃度葡萄糖培基對體外培養(yǎng)的ARPE-19細胞增殖分化以及VEGF、PEDF表達的影響。
　　 2檢測不同濃度葡萄糖培基培養(yǎng)的ARPE-19細胞中Hox基因表達，探討其與PDR發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。選擇各組間表達差異最明顯的某一Hox基因進行下一步實驗。
　　 3觀察篩選的目的基因?qū)RPE-19細胞增殖分化和表達VEGF、PEDF的影響及探討其可

7、能機制。
　　 方法：
　　 1分別用高糖(18mM)和正常糖(5.5mM)DMEM培基傳代培養(yǎng)ARPE-19，比較傳代后兩組細胞每天(1-8天)增殖數(shù)量以及細胞形態(tài)；設(shè)高糖組和正常糖組(NG1：培養(yǎng)7天細胞組；NG2：培養(yǎng)14天細胞組；NG3：培養(yǎng)21天細胞組)細胞分別為對照組和實驗組。RT-PCR和westernblot分別檢測各組細胞中VEGF、PEDF的表達。
　　 2設(shè)高糖組和正常糖組細胞分別為實驗組和

8、對照組。應(yīng)用Hox族基因特異引物，采用RT—PCR結(jié)合圖像分析法檢測兩組細胞中39個Hox基因mRNA的表達水平。統(tǒng)計分析比較兩組細胞中Hox族基因表達水平，用基因/GAPDH灰度比值表示。選擇兩組細胞中表達差異最明顯的HoxB7基因進行下一步實驗。
　　 3將ARPE-19細胞分為五組：ARPE-HOXB71、ARPE-HOXB72、ARPE-HOXB73、ARPE-Neg和未轉(zhuǎn)染組。針對HoxB7基因的mRNA序列設(shè)計了三條

9、HoxB7特異性的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)和一條陰性對照negtive-siRNA，并分別克隆入pRNAT質(zhì)粒載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入ARPE-19細胞，熒光顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染效率，半定量RT-PCR和Werstern blot方法檢測對HoxB7基因干擾效果以及各組細胞VEGF、PEDF的表達；利用MTT增生試驗，觀察HoxB7基因?qū)Ω鹘M細胞增生能力的影響；比較轉(zhuǎn)染后各組細胞形態(tài)。
　　

10、 結(jié)果：
　　 1.HG組細胞長呈紡錘形或更狹長形狀，而NG組細胞呈圓形或鵝卵石形。第4天開始HG組細胞較NG組細胞明顯增殖，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)第8天時，HG組細胞數(shù)量由5.1±0.3E+04/ml增殖至31.2±2.1E+04/ml，較初始增殖約500％;而NG組細胞數(shù)量4.5±0.4E+04/ml增殖至14.1±1.2E+04/ml，較初始增殖不到200％。應(yīng)用RT-PCR檢測：NG組較HG組細

11、胞PEDF表達水平增加， NG1與HG比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),NG2和NG3組分別與HG組比較差異具有顯著性(P<0.01)；NG組較HG組VEGF表達水平降低，NG2組與HG比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，NG3組與HG組比較差異具有顯著性(P<0.01)。應(yīng)用Western blot檢測：各實驗組同對照組比較，隨時間延長VEGF的蛋白表達逐漸降低，差異具有顯著性(P<0.01)；各實驗組同對照組比較，隨時間延

12、長PEDF的蛋白表達逐漸增加，差異具有顯著性(P<0.01)。
　　 2.Hox基因全部39個成員中有12個成員在兩組細胞中都有表達，它們是HoxA5，HoxA6，HoxA13，HoxB3，HoxB5，HoxB7，HoxB13，HoxC6，HoxC13，HoxD1，HoxD3，HoxD10；HoxA5，HoxA13，HoxC13、HoxD1、HoxD3在兩組細胞中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義；HG組與NG組比較，HoxA6、HoxB3

13、、HoxC6、HoxD10的表達較NG組細胞降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；HG組中HoxB5、HoxB7、HoxB13基因的表達較NG組細胞增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);HoxB7是兩組細胞中表達差異最顯著的基因之一。
　　 3.與轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染組比較，干擾質(zhì)粒pRNAT-HoxB71特異并有效的抑制了ARPE-19細胞中HoxB7基因的表達，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，HoxB7-mRNA和蛋白抑制率依次為(50

14、.15±2.31)％(55.41±2.99)％;且
　　 VEGF的表達較未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組降低(P<0.01)，同時PEDF的表達較未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組增高(P<0.01)。干擾HoxB7基因后，
　　 MTT檢測ARPE-19細胞增生能力下降，其在干擾48h和72h后的增殖抑制率依次為(16.18±2.53)％和(25.02±5.02)％。HoxB7基因干擾后，ARPE-19細胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變。
　　

15、結(jié)論：
　　 1高糖可刺激hRPE細胞增殖分化；控制血糖可從轉(zhuǎn)錄及翻譯水平上調(diào)hRPE細胞PEDF的表達，并抑制VEGF的表達。
　　 2 Hox基因家族中有12個成員(HoxA5、HoxA6、HoxA13、HoxB3、HoxB5，HoxB7，HoxB13，HoxC6，HoxC13，HoxD1，HoxD3，HoxD10)可能參與了hRPE細胞的增殖分化過程；其中，HoxA6、HoxB3、HoxB5、HoxB7、HoxB1