枸杞多糖對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞抗衰老的影響.pdf

1、目的:年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)是一種嚴重影響老年人視力的致盲性眼病,其發(fā)生與視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)的衰老密切相關。RPE細胞吞噬功能的下降、胞內脂褐素的不斷累積及細胞增生能力的降低均是RPE細胞衰老的重要表現(xiàn)。如何延緩RPE的老年性進程,對AMD的防治有重要的臨床意義。枸杞多糖是中藥枸杞子的提取物,現(xiàn)已證明其具有

2、清除細胞內氧自由基和脂褐素、促進細胞活性及保護細胞膜等作用。本實驗以枸杞多糖為干預藥物,觀察不同濃度枸杞多糖對RPE細胞吞噬作用、清除RPE胞內脂褐素及對RPE細胞增生活性的影響,來探討枸杞多糖對RPE細胞抗衰老作用的影響。
　　方法:1.體外培養(yǎng)hRPE細胞株并觀察細胞生長情況;取處于對數(shù)生長期的RPE細胞,用CCK-8法篩選適合進行hPRE細胞相關實驗的枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide,L

3、BP)濃度。
　　2.枸杞多糖對RPE細胞吞噬作用的影響:用密度梯度離心法提取豬眼光感受器外節(jié)(photorecepter ourer segment,POS);用熒光顯微鏡定性及定量分析不同濃度枸杞多糖對hRPE細胞干預12h、24h后吞噬POS的影響。
　　3.枸杞多糖對RPE細胞清除脂褐素作用和細胞增生活性的影響:將POS與hRPE共養(yǎng)3周,建立豬POS誘導的人RPE脂褐素形成模型,通過流式細胞技術、透射電鏡技術等定性

4、及定量記錄脂褐素的累積過程;并通過流式細胞技術觀察不同濃度枸杞多糖干預RPE細胞12h、24h、48h后對脂褐素清除作用的影響;通過MTT比色法觀察不同濃度枸杞多糖干預RPE細胞12h、24h、48h后對RPE細胞增生活性的影響。
　　結果:1.hRPE細胞(hRPE-19細胞株)呈長梭型或多邊形,單層貼壁生長,胞漿豐富、透明,胞核透亮,細胞邊界清晰。用CCK-8法檢測枸杞多糖干預后hRPE細胞吸光度值(OD),篩選出適于人hRP

5、E細胞實驗的枸杞多糖藥物濃度分別為10ug/ml、100ug/ml、1000g/ml,來用于實驗研究;濃度為10mg/m1、100mg/m1組與未加藥物組hRPE細胞吸光度(0D)值比較明顯降低,即抑制hRPE細胞的活性,不可用于實驗研究。
　　2. Optiprep密度梯度法可以提取到較高純度的光感受器外節(jié)(POS),制備好的POS光鏡下大小均勻,呈棒狀;濃度為100ug/ml、1000um/ml組的hRPE細胞平均吞噬POS的

6、熒光面積明顯大于對照組(P＜0.01),即其吞噬POS的數(shù)量多于對照組;濃度為10ug/m1組的hRPE細胞吞噬POS的熒光面積較對照組未見明顯差異(P＞0.05)。結果示較高濃度范圍內的枸杞多糖對人RPE細胞的吞噬功能有一定的促進作用。
　　3.通過熒光顯微鏡和投射電鏡技術可以觀察到hPRE與POS共培養(yǎng)3周后,可以成功造出RPE脂褐素累積模型;濃度分別為10ug/ml、100ug/ml、1000g/ml的枸杞多糖作用于hRPE

7、12h、24h、48h后,各實驗組細胞脂褐素的清除面積大于對照組,且有明顯差異(P＜0.01),并與濃度和作用時間呈正相關;濃度分別為10ug/ml、100ug/ml、1000g/ml的枸杞多糖作用于h RPE12h、24h、48h后,實驗組細胞的增生活性優(yōu)于對照組,且有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);并隨藥物作用時間的延長而增強。
　　結論:1.枸杞多糖在較低濃度范圍內對hRPE細胞的生長無不良影響;在較高濃度范圍會抑制細胞生長。<