枸杞多糖對人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞光損傷凋亡線粒體信號傳導(dǎo)途徑的影響.pdf

1、目的：
　　以人視網(wǎng)膜色素上皮（human retinalpigment epithelium，hRPE）細(xì)胞為研究對象，研究不同光照時長對體外培養(yǎng)的hRPE細(xì)胞損傷凋亡的影響，篩選出最佳光照時長建造光損傷模型。研究hRPE細(xì)胞光損傷以及枸杞多糖干預(yù)防治后細(xì)胞中參與凋亡的蛋白分子表達(dá)量的變化，探討枸杞多糖對hRPE細(xì)胞光損傷保護(hù)可能的信號傳導(dǎo)途徑，為臨床應(yīng)用枸杞多糖治療年齡相關(guān)性黃斑變性以及視網(wǎng)膜光損傷性疾病提供理論依據(jù)。

2、　　方法：
　　1、體外培養(yǎng)hRPE細(xì)胞（ARPE-19），用三基色冷光燈模擬自然光源，選取同一光照強(qiáng)度(2500±500)Lux，不同光照時長（2h，4h，6h）對細(xì)胞進(jìn)行光損傷干預(yù)，通過MTS細(xì)胞增殖與毒性檢測出不同光照時長對hRPE細(xì)胞活力的影響；流式細(xì)胞儀檢測出不同光照時長對hRPE細(xì)胞凋亡的影響，篩選出建造光損傷模型的最佳光照時長。
　　2、制備高低安全濃度的枸杞多糖培養(yǎng)基，光照前1h孵育體外培養(yǎng)的hRPE細(xì)胞后進(jìn)

3、行光照實驗，設(shè)置四個實驗分組：A組：空白對照組；B組：光損傷模型組；C組：0.01mg/ml枸杞多糖+光損傷組；D組：1mg/ml枸杞多糖+光損傷組。通過透射電子顯微鏡進(jìn)行hRPE光損傷后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察及拍片；采用蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測光損傷以及枸杞多糖的防治對體外培養(yǎng)的hRPE細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C(Cyt-C)、caspase-9及caspase-3蛋白表達(dá)的影響，來探討枸杞多糖對hRPE細(xì)胞光損傷保護(hù)的分子機(jī)

4、制，進(jìn)一步探討hRPE細(xì)胞光損傷后細(xì)胞凋亡可能的信號傳導(dǎo)途徑。
　　結(jié)果：
　　1、MTS法檢測結(jié)果顯示，hRPE細(xì)胞活力率組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=16.075，P=0.000)。與空白對照相比，不同光照時長對細(xì)胞活力均有抑制作用，光照2h和光照4h組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），光照6h組細(xì)胞活力較光照4h組和光照2h組下降(P＜0.05)，光照時間越長，細(xì)胞損傷越嚴(yán)重。
　　2、不同時長光照結(jié)束后，經(jīng)A

5、nnexin-VFITC/PI雙染法檢測結(jié)果顯示，不同光照時長對細(xì)胞主要影響為凋亡。但由于實驗結(jié)果中晚期凋亡的細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)分意義不大，故針對早期凋亡率進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。hRPE早期凋亡率組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=28.494，P=0.000)。不同時長光照組hRPE細(xì)胞的早期凋亡率均較空白對照組升高(P＜0.05)，光照4h早期凋亡率較光照2h早期凋亡率升高(P＜0.05)，光照6h早期凋亡率較光照4h早期凋亡率降低(P＜0.05

6、)。光照4h組的早期凋亡率明顯高于其他組，同時保有較高的細(xì)胞活力。
　　3、透射電子顯微鏡結(jié)果顯示：正常hRPE細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞形態(tài)大小不一，細(xì)胞膜上可見大量微絨毛，胞膜完整，細(xì)胞核呈圓形或卵圓形，細(xì)胞基底部質(zhì)膜內(nèi)褶發(fā)達(dá)，胞質(zhì)內(nèi)有大量黑素顆粒。細(xì)胞內(nèi)可見吞噬體、大量的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體、較多的線粒體和溶酶體、少量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器。經(jīng)過光照的hRPE細(xì)胞明顯走向凋亡的形態(tài)，電鏡下觀察到電鏡切片細(xì)胞數(shù)量明顯減少，可見

7、散在的細(xì)胞碎片。細(xì)胞膜上的微絨毛消失，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整無破裂，胞質(zhì)內(nèi)部細(xì)胞器變少，有大量的空泡。細(xì)胞核成波紋狀，核內(nèi)可見細(xì)胞核沿核膜內(nèi)側(cè)邊緣開始固縮、碎裂，核染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)、邊集、丟失，可見凋亡小體。結(jié)果表明：經(jīng)過光照后hRPE細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的損傷，甚至凋亡。
　　4、蛋白免疫印跡（Western-blot）法檢測hRPE細(xì)胞內(nèi)Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白因子的表達(dá)量，分別在14KD、46KD、31K

8、D處檢測到Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3的目的條帶，結(jié)果顯示：與空白對照組相比，單獨經(jīng)過光照的光損模型組細(xì)胞內(nèi)的Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.05)；用枸杞多糖防治的兩個組與光損模型組相比有效的抑制了細(xì)胞內(nèi)Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；其中高濃度枸杞多糖（1mg/ml）組可顯著抑制細(xì)胞內(nèi)Cyt-C、

9、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表達(dá)與空白對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05)。以上結(jié)果表明枸杞多糖通過抑制hRPE細(xì)胞內(nèi)Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表達(dá)，達(dá)到保護(hù)hRPE細(xì)胞的目的。提示枸杞多糖可能是通過抑制線粒體信號傳導(dǎo)通路而發(fā)揮對hRPE細(xì)胞保護(hù)作用的。
　　結(jié)論：
　　本實驗從細(xì)胞、蛋白分子水平，研究hRPE細(xì)胞光損傷后細(xì)胞凋亡的信號傳導(dǎo)途徑，結(jié)果顯示：1、不同時長的光照對

10、hRPE細(xì)胞會有不同程度的損傷，其中給予4h時長光照后，hRPE損傷以早期凋亡為主，同時又保有較高的細(xì)胞活力，符合我們實驗所需要光損傷模型的建造條件。2、體外培養(yǎng)的hRPE細(xì)胞經(jīng)過光照損傷后不僅細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變而且上調(diào)了細(xì)胞內(nèi)的Cyt-C、Caspase-3、Caspase-9等蛋白因子的表達(dá)量，枸杞多糖通過抑制hRPE細(xì)胞內(nèi)Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表達(dá)，達(dá)到保護(hù)hRPE細(xì)胞的目的。這一保護(hù)作用可能