枸杞多糖對藍光誘導(dǎo)損傷的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞抗氧化作用機制的研究.pdf

1、目的:利用藍光誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損傷建立年齡相關(guān)性黃斑變性(Age-related macular degeneration,AMD)的實驗?zāi)Ｐ?通過觀察不同濃度的枸杞多糖對其干預(yù),探討枸杞多糖防治AMD的可行性。
　　方法:1.體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(human retinal pigment epithelial cell,hRPE cell),并通過倒置相差顯微鏡觀察其生長情況。
　　2.配制含終

2、濃度分別為10mg/ml、1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml枸杞多糖的培養(yǎng)基體外培養(yǎng)hRPE細(xì)胞,通過CCK-8法篩選出適合hRPE細(xì)胞生長的枸杞多糖的安全濃度。
　　3.實驗分為五組:A組(正常RPE細(xì)胞)-正常對照組,B組(RPE+光照)-光照損傷組,C組(RPE+光照+1mg/ml枸杞多糖),D組(RPE+光照+0.1mg/ml枸杞多糖),E組(RPE+光照+0.01mg/ml枸杞多糖)。B組~E組光照采用白

3、色冷光源,波長范圍為470nm~52Onm藍色濾光片,光照強度(2000±500)LUX的藍光連續(xù)照射hRPE細(xì)胞12h,建立hRPE細(xì)胞光損傷模型,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。采用線粒體活性氧測定試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒,通過流式細(xì)胞儀進行檢測線粒體活性氧、線粒體膜電位和凋亡的情況,進而研究枸杞多糖對藍光誘導(dǎo)損傷的hRPE細(xì)胞的影響及可能的作用機制。
　　結(jié)果:1.倒置相差顯

4、微鏡下見:體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(hRPE細(xì)胞)細(xì)胞呈梭形或多邊形,單層貼壁生長,細(xì)胞邊界清楚。
　　2. CCK-8法檢測顯示:
　　(1)加入終濃度分別為10mg/ml的枸杞多糖組OD值明顯低于單純視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);
　　(2)加入終濃度分別為1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml的枸杞多糖組與單純視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞組OD值未見明顯差異,無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0

5、.05)。
　　3.藍光損傷模型建立后,倒置相差顯微鏡下觀察A-E組細(xì)胞見:A組細(xì)胞呈梭形或多邊形,單層貼壁生長,細(xì)胞邊界清楚。B組一些細(xì)胞體積縮小,變圓,折光性改變,細(xì)胞周圍見透亮圈;細(xì)胞核縮小,分裂為多個或出現(xiàn)核邊聚;培養(yǎng)液中出現(xiàn)圓形懸浮細(xì)胞及細(xì)胞碎片。C-E組細(xì)胞呈梭形或多邊形,單層貼壁生長,細(xì)胞邊界清楚,少許細(xì)胞積縮小,變圓,折光性改變,培養(yǎng)液中未出現(xiàn)圓形懸浮細(xì)胞及細(xì)胞碎片。
　　4.Annexin V-FITC/P

6、I凋亡:
　　(1)A組凋亡細(xì)胞數(shù)量最少;
　　(2)B組凋亡細(xì)胞數(shù)量最多;
　　(3)C~E組凋亡細(xì)胞數(shù)量與B組細(xì)胞差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);
　　(4)C組、D組凋亡細(xì)胞數(shù)量與A組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　5.線粒體膜電位檢測:
　　(1)A組陽性細(xì)胞數(shù)量最多;
　　(2)B組陽性細(xì)胞數(shù)量最少;
　　(3)C~E組陽性細(xì)胞數(shù)量與B組細(xì)胞差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0

7、5);
　　(4)C組、D組陽性細(xì)胞數(shù)量與A組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　6.線粒體活性氧檢測:
　　(1)A組熒光度最大;
　　(2)C~D組熒光度與B組細(xì)胞差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);
　　(3)E組熒光度與B組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:(1)枸杞多糖的安全濃度為1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml。
　　(2)枸杞多糖能抑制藍光誘導(dǎo)損傷的