黃芪甲苷對甲基乙二醛誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細胞損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是1型糖尿病和2型糖尿病患者常見的微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致成年人失明的主要原因。研究表明，視網(wǎng)膜病變與自由基介導(dǎo)的氧化損傷有關(guān)，氧化應(yīng)激反應(yīng)可調(diào)節(jié)細胞的生理功能和生化反應(yīng)，在細胞增殖分化過程中發(fā)揮重要作用。同時視網(wǎng)膜組織在遭受各種有害刺激時，高活性分子如活性氧和活性氮產(chǎn)生過多，超出機體的清除能力，導(dǎo)致氧化還原平衡失調(diào)，從而引起細胞凋亡等病理反應(yīng)。視網(wǎng)膜色素上皮細胞(RPE)處于神經(jīng)視網(wǎng)膜和富含血管的脈絡(luò)膜之間，是

2、外血-視網(wǎng)膜屏障的重要組成部分。RPE間和臨近的內(nèi)皮細胞間的緊密連接對于維持視網(wǎng)膜的完整性至關(guān)重要，研究證實在DR早期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RPE出現(xiàn)損傷。甲基乙二醛(MGO)是一種活性二羰基化合物，作為糖酵解的中間產(chǎn)物，它是晚期糖基化終末產(chǎn)物的前體。在糖尿病患者中血糖的持續(xù)升高，糖酵解增加，MGO大量生成，導(dǎo)致AGEs在RPE基底膜中異常聚集，引發(fā)細胞損傷和DR。
　　黃芪甲苷(AS-Ⅳ)是中藥黃芪的主要活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗衰老、清

3、除氧自由基、改善胰島素抵抗、促進細胞增殖和抗細胞凋亡等多種藥理作用。并且AS-Ⅳ能夠降低糖尿病患者的血糖，抑制糖尿病大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，減少AGEs的形成，因此AS-Ⅳ有可能在MGO誘導(dǎo)的RPE細胞氧化損傷中發(fā)揮保護作用。
　　目的：
　　研究AS-Ⅳ對MGO誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(ARPE-19)損傷的保護作用，并探討其分子機制。
　　方法：
　　用不同濃度的MGO(2、1、0.75和0.5mmol·L

4、-1)誘導(dǎo)ARPE-19細胞損傷，以CCK-8法檢測細胞活力，確定MGO損傷細胞的最佳濃度和時間;以不同濃度的AS-Ⅳ預(yù)給藥6h，然后加入MGO造模，檢測細胞活力，確定AS-Ⅳ保護ARPE-19細胞的最佳濃度。以DCFH-DA為熒光探針檢測細胞內(nèi)ROS的水平，利用試劑盒測定細胞內(nèi)SOD活力和MDA含量，探究AS-Ⅳ對MGO引起的ARPE-19細胞氧化應(yīng)激的影響。以Hoechst33342對細胞核進行染色，利用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)觀察細胞核的形

5、態(tài)和藍染情況;對細胞進行AnnexinⅤ/PI雙染，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況;以JC-1為熒光探針對線粒體膜電位進行檢測。Western Blot法檢測細胞凋亡的線粒體通路中Bcl-2、Bax和PARP蛋白的表達和PI3K/Akt通路中p-Akt的表達，利用熒光酶標法檢測Caspase-9和Caspase-3的活化水平，從而探究AS-Ⅳ保護ARPE-19細胞分子機制。
　　結(jié)果：
　　1、隨著MGO濃度的增加，ARPE

6、-19的細胞活力逐漸降低。當MGO孵育16h，濃度為1mmol·L-1時細胞活力為60％左右，即選取1mmol·L-1MGO孵育16h作為最佳的造模條件;AS-Ⅳ預(yù)給藥能提高細胞活力，減輕MGO對細胞的損傷，當AS-Ⅳ濃度10μmol·L-1時細胞活力提高至最大，與模型組相比有顯著性差異。
　　2、ROS染色結(jié)果顯示，MGO組ROS產(chǎn)生明顯增多，熒光強度顯著增加，AS-Ⅳ預(yù)給藥后熒光強度減弱，證明AS-Ⅳ能夠減少ROS的產(chǎn)生;并且

7、與MGO組相比，AS-Ⅳ預(yù)給藥能顯著逆轉(zhuǎn)MGO引起的SOD活力降低和MDA水平升高。
　　3、Hoechst33342染色發(fā)現(xiàn)正常組細胞核呈長橢圓狀，呈均勻淡藍著色;MGO組部分細胞核皺縮或破碎，染色不均勻，有致密的亮藍著色;AS-Ⅳ預(yù)給藥后細胞核形態(tài)明顯改善，僅有少數(shù)細胞核呈不均勻藍染。AnnexinⅤ/PI雙染流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，MGO能誘導(dǎo)ARPE-19細胞發(fā)生凋亡，MGO組細胞凋亡率顯著高于對照組，AS-Ⅳ能顯著降低M

8、GO誘導(dǎo)的細胞凋亡，起到抗凋亡的作用。
　　4、JC-1染色結(jié)果顯示，與正常組相比，MGO組紅/綠熒光比值顯著降低;與MGO組相比，AS-Ⅳ預(yù)給藥后細胞紅/綠熒光比值明顯提高，表明AS-Ⅳ預(yù)給藥能夠抑制MGO誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降。Western Blot結(jié)果顯示，與正常組相比，MGO組Bcl-2/Bax比值顯著下降，AS-Ⅳ預(yù)給藥能提高Bcl-2蛋白的表達水平，顯著提高Bcl-2/Bax比值;另外，AS-Ⅳ能夠抑制具有DNA修復(fù)

9、功能的PARP的裂解，并提高Akt的活化水平，發(fā)揮促進細胞存活的作用。熒光酶標法結(jié)果顯示，MGO組細胞Caspase-9和Caspase-3活化程度明顯升高，AS-Ⅳ預(yù)給藥能顯著降低Caspase-9和Caspase-3活化水平，起到調(diào)節(jié)細胞凋亡的作用。
　　結(jié)論：
　　AS-Ⅳ對MGO損傷的ARPE-19有明顯的保護作用。AS-Ⅳ能夠明顯抑制MGO誘導(dǎo)的細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少ROS的生成和MDA的含量，增加抗氧化酶SOD的