Protectin DX對氧化應激狀態(tài)下人視網膜色素上皮細胞的保護作用及機制的初步研究.pdf

1、目的:二十六碳烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)高度富集于視網膜色素上皮(Retinal pigment epithelium，RPE)細胞，經脂氧合酶代謝可被轉化為protectin DX(PDX)。本研究目的為確定DHA衍生物PDX是否對氧化應激狀態(tài)下ARPE-19細胞產生保護作用及其機制，為脂類及其衍生物在年齡相關性黃斑變性防治研究方面提供實驗室證據。
　　方法:取生長良好的ARPE-19（第16-18

2、代）細胞，以完全DMEM/F12培養(yǎng)基均勻接種于96孔板（2×104/0.1ml/孔）或六孔板（4×105/2.0 ml/孔），每日于倒置顯微鏡下觀察。當細胞生長至接近80％融合時，以無血清DMEM/F12培養(yǎng)基液饑餓細胞24小時。在200μM叔丁基過氧化氫(tert-butylhydropero xide，t-BH)處理2h對細胞進行氧化應激誘導前，分別以0.05μM、0.5μM、1μM、5μM或10μM PDX預孵育ARPE-19細

3、胞20 min。氧化應激誘導結束后，以無血清DMEM/F12培養(yǎng)基液清洗細胞3次，去除多余t-BH。然后以含1％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基液繼續(xù)處理細胞，按實驗不同檢測時間點收集細胞或細胞上清樣本。其中:1）以含1％ FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基液處理細胞2小時，收集六孔板中的細胞用于實時熒光定量PCR檢測;2）以含1％ FBS的DM EM/F12培養(yǎng)基液處理細胞4小時，收集六孔板中細胞用于細胞內ROS檢測;3）以含1％ FBS的

4、DMEM/F12培養(yǎng)基液處理細胞24小時，收集六孔板中的細胞用于T-AOC和SOD檢測及WB分析，或收集96孔板中的細胞上清用于ELISA檢測。
　　結果:200μM t-BH誘導ARPE-19細胞2h，細胞內dichloro fluorescein熒光強度較正常對照組顯著增強。氧化應激誘導結束后24 h細胞上清VEGF-A蛋白濃度較相同時間點正常對照組VEGF-A濃度增加，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。5μM PDX或10

5、μM PDX預孵育ARPE-19細胞20分鐘，可顯著降低氧化應激誘導后RPE細胞內ROS生成量(P＜0.01)。以1μM、5μM或10μM PDX預孵育20 min，再對ARPE-19細胞進行氧化應激誘導，細胞SOD活性分別是氧化應激模型組的1.28倍、1.37倍和1.48倍，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.01和P＜0.001）;細胞T-AOC分別是氧化應激模型組的1.40％、1.80％和2.07％，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.

6、01，P＜0.001和P＜0.001）。當PDX預孵育濃度≥0.05μM時，相同時間點培養(yǎng)基上清TNF-α蛋白濃度較氧化應激模型組顯著降低，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。當PDX預孵育濃度≥1μM時，培養(yǎng)基上清VEGF-A蛋白濃度較氧化應激模型組顯著降低，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。當PDX預孵育濃度為10μM時，氧化應激后細胞內PGC-1α蛋白表達較氧化應激模型組細胞PGC-1α蛋白表達顯著增加，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.0

7、01)。
　　結論:
　　1)200μM叔丁基過氧化氫處理ARPE-19細胞2小時，細胞內ROS生成量明顯增多，細胞分泌VEGF-A較正常狀態(tài)下顯著增加，細胞活力良好，表現出RPE細胞在經歷慢性氧化應激時的典型特征，可作為體外培養(yǎng)的人視網膜色素上皮細胞氧化損傷模型。
　　2) Protectin DX可以顯著降低叔丁基過氧化氫誘導的炎癥及炎癥相關細胞因子釋放，并通過直接增加PGC-1α表達而增強細胞的抗氧化能力，進一步