葒草素對于氧化應(yīng)激狀態(tài)下人支氣管上皮細(xì)胞的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:氧化應(yīng)激是指機(jī)體在各種不利因素刺激下導(dǎo)致體內(nèi)活性氧的蓄積，氧化與抗氧化失衡的一種狀態(tài)，也是宿主對抗外界病原菌的先天性免疫反應(yīng)重要的防御系統(tǒng)。但過度的氧化應(yīng)激可能導(dǎo)致系統(tǒng)性的炎癥反應(yīng)和組織損傷。相關(guān)研究表明，氧化應(yīng)激與肺部疾?。ㄈ鏑OPD、哮喘等）有明確的關(guān)系:(1)氧化劑可使中性粒細(xì)胞的變形能力減弱，促使其在微循環(huán)中聚集、活化，活化的中性粒細(xì)胞釋放ROS，導(dǎo)致組織損傷;(2)氧化應(yīng)激可以通過激活胞內(nèi)信號通路（如:核因子-KB

2、等）調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的釋放，活化中性粒細(xì)胞，進(jìn)一步放大炎癥損傷作用;(3)通過激活Rho蛋白，氧化應(yīng)激可以引起巨噬細(xì)胞的重構(gòu)，損傷巨噬細(xì)胞的功能，從而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞不能正常清除病原體、異物及凋亡細(xì)胞等;(4)氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致組蛋白去乙酰化酶2活性降低，促使慢阻肺患者對糖皮質(zhì)激素敏感性下降;(5) ROS產(chǎn)生增加可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞釋放蛋白酶，破壞肺組織彈性纖維，促使蛋白酶與抗蛋白酶失衡，導(dǎo)致肺氣腫的發(fā)生。
　　葒草素是傳統(tǒng)中藥竹葉的有效成

3、分，屬于黃酮類化合物。葒草素作用廣泛，具有顯著的抗氧化，抗凋亡，鎮(zhèn)痛，抗脂質(zhì)形成和抗炎等作用。其主要成分已投入臨床使用的有葒葉通心軟膠囊和葒草復(fù)方凍干粉制劑。氧化應(yīng)激狀態(tài)下葒草素對人支氣管上皮細(xì)胞的研究尚不多見，本研究通過體外細(xì)胞學(xué)實驗，應(yīng)用過氧化氫刺激人支氣管上皮細(xì)胞，給予不同濃度的葒草素干預(yù)，檢測其對細(xì)胞存活率、凋亡率、形態(tài)學(xué)及相關(guān)蛋白表達(dá)情況，探討氧化損傷時葒草素對人支氣管上皮細(xì)胞的作用及機(jī)制。
　　實驗方法:
　　1

4、.人支氣管上皮細(xì)胞（16HBE細(xì)胞）的培養(yǎng):RPMI-1640培養(yǎng)基+10％胎牛血清，37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天傳代一次;
　　2.過氧化氫對16HBE細(xì)胞存活率的影響:用不同濃度(20、100、200uM)的H2O2攻擊16HBE細(xì)胞2h，MTT檢測細(xì)胞的存活率;
　　3.不同濃度的葒草素(Orientin)干預(yù)后細(xì)胞存活率的變化:實驗分為以下五組，空白對照組（細(xì)胞加培養(yǎng)基）、H2O2(200uM)、DM

5、SO40uM、Orientin5uM、Orientin10uM、Orientin40uM、H2O2(200uM)+Orientin(5uM)、H2O2(200uM)+Orientin(10uM)、H2O2(200uM)+Orientin(40uM)，干預(yù)的總時間均為2h，MTT檢測細(xì)胞存活率;
　　4.熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)變化:Hoechst33342對16HBE細(xì)胞凋亡染色觀察細(xì)胞形態(tài);
　　5.Annexin-FI

6、TC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率;
　　6.Western Blot方法檢測各組細(xì)胞Cleaved-caspase3/procaspase3凋亡蛋白的表達(dá)情況;
　　7.酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)SOD(U/mg)的活力;
　　8.Orientin干預(yù)后對P-AKT/AKT通路的影響:提取細(xì)胞蛋白，Western Blot方法檢測各組細(xì)胞P-AKT/AKT蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.16HBE細(xì)胞在不

7、同濃度H2O2刺激下細(xì)胞的存活率:予以不同濃度(20、100、200uM) H2O2刺激16HBE細(xì)胞2h，以MTT法檢測細(xì)胞存活率。與Con組（97.88±1.87％）相比，H2O2隨著濃度的增加細(xì)胞存活率逐漸降低，20uM H2O2刺激16HBE細(xì)胞存活率為95.75±3.90％，無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異;100uM的H2O2濃度刺激時，細(xì)胞的存活率為75.86±1.01％，H2O2濃度達(dá)到200uM時，存活率降至57.76±2.10％，

8、差別具有統(tǒng)計學(xué)意義;因此，選擇200uMH2O2作用16HBE細(xì)胞2h為誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的最佳濃度;
　　2.Orientin可以增加氧化應(yīng)激下16HBE細(xì)胞的存活率:實驗分為以下幾組:空白對照組、H2O2(200uM)、DMSO40uM、Orientin5uM、Orientin10uM、Orientin40uM、H2O2+Oriemin(5uM)、H2O2+Orientin(10uM)、H2O2+Orientin(40uM),MTT

9、法檢測細(xì)胞存活率。DMSO40uM及Orientin(5uM、10uM、40uM)組和空白對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異。H2O2組的細(xì)胞存活率與空白對照組相比，明顯降低，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。H2O2+Orientin5uM時與H2O2組相比，細(xì)胞存活率有所增加，但差別無統(tǒng)計學(xué)意義;H2O2+Orientin10uM時細(xì)胞存活率明顯增加，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義; H2O2+Orientin40uM時和H2O2相比較細(xì)胞存活率增加，差別無統(tǒng)計學(xué)意義

10、;
　　3.Hoechst33342染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué):熒光顯微鏡下觀察空白對照組16HBE細(xì)胞活力良好，染料能少許進(jìn)入正常細(xì)胞，細(xì)胞核顏色為低藍(lán)色，核染色均勻;H2O2組凋亡細(xì)胞較多，膜通透性增加，核呈亮藍(lán)色，有些核破裂、皺縮、染色不均勻;Orientin10uM+H2O2組凋亡細(xì)胞減少，細(xì)胞核低藍(lán)色多，亮藍(lán)色少，細(xì)胞核大部分染色較均勻;Orientin40uM+H2O2組凋亡細(xì)胞較H2O2組有所減少，亮藍(lán)色，低藍(lán)色多;

11、r>　　4.Annexin-FITC/PI流式檢測細(xì)胞凋亡率:實驗分為以下幾組Con、H2O2、H2O2+Ori10uM、H2O2+Ori40uM。與Con組凋亡率（0.21±0.05％）相比，H2O2組凋亡率為（66.74±7.53％），早凋加晚凋的細(xì)胞數(shù)明顯增多，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。H2O2+Ori10uM組凋亡率（49.02±6.20％）與H2O2組相比，早凋加晚凋的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差別具有統(tǒng)計學(xué)差異。H2O2+Ori40uM組

12、凋亡率（51.21±6.98％）與H2O2組相比，早凋加晚凋的細(xì)胞數(shù)量減少，但差別無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異;
　　5.Orientin可以拮抗氧化應(yīng)激狀態(tài)下Caspase3凋亡蛋白的表達(dá):Western blot結(jié)果顯示，和空白對照組相比，氧化應(yīng)激組的16HBE細(xì)胞Cleaved-caspase3表達(dá)水平增加，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義;與H2O2組相比，H2O2+Orientin10uM干預(yù)后，Cleaved-caspase3凋亡蛋白表達(dá)水平

13、降低，總的Caspase3水平無明顯變化，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。H2O2+Orientin40uM組較H2O2組凋亡蛋白的表達(dá)有所降低，具有統(tǒng)計學(xué)差異;
　　6.酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶SOD活力:橫坐標(biāo)為實驗分組:CON、H2O2、H2O2+Ori10uM，H2O2+Ori40uM，縱坐標(biāo)反應(yīng)SOD(U/mg)的活力。由圖7、表5可見和CON組(68.76±2.99 U/mg)相比，H2O2組(34.71±2.55 U/mg

14、) SOD的活力明顯下降，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義; Orientin(10uM)+H2O2組SOD的活力(45.09±2.19 U/mg)較H2O2組有所增加，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義;Orientin(40uM)+H2O2組SOD的活力(41.05±0.75 U/mg)較H2O2組有所增加，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義;
　　7.P-AKT信號通路參與了Orientin對氧化應(yīng)激狀態(tài)下支氣管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用:Western blot法檢測16HB

15、E細(xì)胞的P-AKT/AKT蛋白表達(dá)。和CON組相比，H2O2組P-AKT/AKT的蛋白表達(dá)水平明顯降低，H2O2+Orientin(10uM)組與氧化應(yīng)激組相比，P-AKT/AKT蛋白的表達(dá)水平明顯增加，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。H2O2+Orientin(40uM)組較H2O2組P-AKT/AKT表達(dá)有所增加，但差別無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1、過氧化氫刺激可導(dǎo)致體外培養(yǎng)16HBE細(xì)胞存活率降低;
　　2、一定濃度的