自然老化大鼠椎間盤氧化應激狀態(tài)的研究.pdf

1、研究背景：
　　 在我國乃至全世界范圍內(nèi),腰痛始終在威脅人類的健康。腰痛一直是骨科的常見病,腰痛影響了有很多人的正常生活和工作。雖然導致腰痛的確切病因到現(xiàn)在為止還并不清楚,但人們普遍接受的一個病因是椎間盤的增齡性改變。隨著年齡的增長,椎間盤逐漸發(fā)生退變,而且退變的速度也在逐漸加快,尤其是腰椎的退變是導致椎間盤源性腰痛的主要原因。
　　 通常認為當氧自由基的產(chǎn)生與清除之間的平衡被打破時就會出現(xiàn)氧化應激。這種平衡被打破的因為

2、可能來自體內(nèi)也可能來自體外,而由此導致的損傷是細胞衰老的主要因為,細胞通過一系列的抗氧化系統(tǒng)抵制自由基來保護自己,細胞外的抗氧化系統(tǒng)也參與抵制和減輕氧化損傷。衰老是一個多因素作用的過程,氧化應激與衰老之間存在重要聯(lián)系,衰老是導致椎間盤退變的一個重要因素,但是目前對于自然老化的大鼠椎間盤氧化應激狀態(tài)并不清楚,因而本文擬研究自然老化的大鼠椎間盤氧化應激狀態(tài)。
　　 目的：
　　 研究自然老化的大鼠椎間盤氧化應激狀態(tài),揭示椎間

3、盤增齡性改變與氧化應激之間的關系,并探討氧化應激在椎間盤增齡性改變中的作用。
　　 方法：
　　 1、實驗用清潔級雄性純種健康SD大鼠(國家A級實驗動物,南方醫(yī)科大學動物實驗中心提供)60只,其中青年組大鼠(3月齡)20只,成年組大鼠(6月齡)20只,老年組大鼠(22月齡)20只,采取動脈血,離心后留血清,切取椎間盤組織,制成組織勻漿。
　　 2、每組選5例做組織學檢測:脫鈣,脫水后作運動節(jié)段正中矢狀切片,用蘇木

4、素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)以及番紅-固綠(safranino-fastgreen)進行椎間盤標本染色,并根據(jù)顯微鏡下觀察結(jié)果進行組織學評分。
　　 3、組織學評分:分為5項,每項1-3分,最高為15分,最低為5分。分別為纖維環(huán)的細胞組成,纖維環(huán)形態(tài),纖維環(huán)與髓核交界區(qū),髓核的細胞組成,髓核的形態(tài)。
　　 4、生物化學檢測:采用硝酸還原法檢測椎間盤組織勻漿及血清中一氧化氮(Nitrogenmono

5、xide,NO)的含量；采用黃嘌呤氧化酶法測定椎間盤組織勻漿及血清中超氧化物歧化酶活力；采用硫代巴比妥酸(TBA)法檢測椎間盤組織勻漿及血清中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量；采用分光光度法測定血清及椎間盤組織中晚期氧化蛋白產(chǎn)物(Advancedoxidationproteinproducts,AOPP)的含量。
　　 5、統(tǒng)計分析:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。所得數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差((X)±

6、S)表示。多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,組間多重比較,采用LSD法,P<0.05為具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、組織學檢測發(fā)現(xiàn)青年組大鼠椎間盤內(nèi),完整的近圓形的髓核占據(jù)椎間盤50％以上的區(qū)域。星狀的髓核細胞均勻的分布于髓核中,纖維環(huán)排列規(guī)則,各層纖維軟骨板呈同心圓狀分布,沒有斷裂,成纖維細胞分布其間。成年組大鼠椎間盤出現(xiàn)一定程度的退變,髓核呈圓形或不規(guī)則形,在椎間盤內(nèi)占據(jù)的區(qū)域少于1/2,但多于1/3。髓核

7、細胞的數(shù)量減低,部分成簇分布,纖維環(huán)向內(nèi)膨出、皺縮或破裂的纖維環(huán)低于纖維環(huán)的1/3。成纖維細胞或軟骨細胞比例均低于75％,纖維環(huán)與髓核輕度分離。老年大鼠椎間盤進一步退變,髓核細胞數(shù)量進一步減少,殘余細胞成簇分布,髓核形態(tài)不規(guī)則,纖維環(huán)中軟骨細胞比例增大,破裂皺縮的纖維增加,纖維與髓核重度分離。方差分析三組椎間盤評分有統(tǒng)計學差異(F=42.818；P=0.000),組間多重比較提示:青年組評分顯著小于成年組和老年組(P=0.000；P=0

8、.000),成年組顯著小于老年組(P=0.002)。
　　 2、氧化應激指標檢測:
　　 (1)NO檢測結(jié)果
　　 通過硝酸還原酶法,測定OD值經(jīng)公式計算可得到大鼠血清及椎間盤組織勻漿中NO含量。青年組大鼠血清中NO含量為15.1403±3.9712μmol/L,椎間盤勻漿中的含量為18.6357±16.3681μmol/gprot；成年組大鼠血清中NO含量為15.8841±4.3315μmol/L,椎間盤勻漿中

9、的含量為37.7185±20.6398μmol/gprot;老年組大鼠血清中NO含量為16.0915±4.8031μmol/L,椎間盤勻漿中的含量為49.1593±28.7779μmol/gprot,隨著年齡的增長,大鼠血清中NO的含量逐漸增加。但青年組、成年組及老年組三組之間差別不顯著(F=0.261,P=0.771)。椎間盤勻漿中NO含量逐漸增高,有顯著差異(F=9.374,P=0.000)。組間多重比較:椎間盤組織勻漿中NO含量老

10、年組和成年組均顯著高于青年組(P=0.000;P=0.010),老年組與成年組之間無顯著差異(P=0.114)。
　　 (2)SOD檢測結(jié)果
　　 通過黃嘌呤氧化酶法測定大鼠血清及椎間盤勻漿中超氧化物歧化酶活力:青年組大鼠血清中SOD活力為187.6387±6.4206U/ml,椎間盤勻漿中的SOD活力為98.5516±24.8518U/mgprot；成年組大鼠血清中SOD活力為182.2228±5.5937U/ml,椎

11、間盤勻漿中的SOD活力為86.5944±26.8894U/mgprot;老年組大鼠血清中SOD活力為179.9398±6.9553U/ml,椎間盤勻漿中SOD活力為69.2931±25.9436U/mgprot,隨著年齡的增長,大鼠血清中SOD的活力有逐漸下降趨勢?？傮w講,三組之間存在統(tǒng)計學差異(F=7.777,P<0.001)。組間多重比較:青年組顯著高于成年組及老年組(P=0.009；P=0.000)。成年組與老年組之間無顯著差別(

12、P=0.114)。椎間盤勻漿中SOD活力逐漸減低,有顯著差異(F=6.448,P=0.003)。組間多重比較:椎間盤組織勻漿中SOD活力老年組顯著低于青年組和成年組(P=0.001；P=0.039),青年組與成年組之間無顯著差異(P=0.150)。
　　 (3)通過硫代巴比妥酸(TBA)法檢測大鼠血清及椎間盤MDA含量,青年組大鼠血清中MDA含量為6.7615±2.2892nmol/ml,椎間盤勻漿中的含量為5.4613±3.7

13、687nmol/mgprot；成年組大鼠血清中MDA含量為8.3463±2.7170nmol/ml,椎間盤勻漿中的含量為6.2193±4.1821nmol/mgprot;老年組大鼠血清中MDA含量為12.1078±2.4669nmol/ml,椎間盤勻漿中的含量為8.9931±4.8440nmol/mgprot,隨著年齡的增長,大鼠血清中MDA濃度有逐漸增高的趨勢?？傮w講,三組之間存在統(tǒng)計學差異(F=24.184,P=0.000)。組間多

14、重比較:青年組顯著低于成年組及老年組(P=0.050；P=0.000)。成年組顯著低于老年組(P=0.000)。椎間盤勻漿中MDA濃度逐漸增高,有顯著差異(F=3.760,P=0.029)。組間多重比較:椎間盤組織勻漿中MDA濃度老年組顯著高于青年組和成年組(P=0.012;P=0.045),青年組與成年組之間無顯著差異(P=0.578)。
　　 (4)AOPP檢測結(jié)果
　　 通過分光光度法測定大鼠血清及椎間盤組織勻漿中

15、晚期氧化蛋白產(chǎn)物的含量,青年組大鼠血清中AOPP含量為37.2310±8.9431μmol/L,椎間盤勻漿中的含量為55.7073±21.2910μmol/mgprot；成年組大鼠血清中AOPP含量為69.2388±17.2419μmol/L,椎間盤勻漿中的含量為93.3990±25.3464μmol/mgprot；老年組大鼠血清中AOPP含量為82.9855±20.2328μmol/L,椎間盤勻漿中的含量為107.4738±33.05

16、02μmol/mgprot。隨著年齡的增長,血清和椎間盤組織中AOPP的含量呈增加趨勢,血清中三組之間差別有統(tǒng)計學意義(F=42.040,P=0.000),椎間盤組織勻漿中三組之間也有統(tǒng)計學差異(F=19.645,P=0.000)組間多重比較:血清中AOPP含量老年組和成年組均顯著高于青年組(P=0.000；P=0.000),老年組與成年組之間有顯著差異(P=0.009)；椎間盤組織均漿中AOPP含量老年組和成年組均顯著高于青年組(P=