大鼠腎臟再灌注損傷模型肺內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)及PrxVI的表達(dá)變化.pdf

1、腎臟不僅能排泄體內(nèi)代謝廢物，維持機(jī)體鈉、鉀、鈣等電解質(zhì)穩(wěn)定及酸堿平衡，還具有內(nèi)分泌功能。因此，腎臟對(duì)維持整個(gè)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡至關(guān)重要。有研究表明:當(dāng)腎臟功能受損時(shí)，其鄰近和遠(yuǎn)端器官如心、肺、肝、腸和腦等的功能也會(huì)嚴(yán)重受損[1]。
　　腎缺血再灌注損傷(Renal ischemia reperfusion injury, RIRI)是急性腎動(dòng)脈阻斷或腎臟移植等臨床治療過程中常見的病理生理過程。它也是導(dǎo)致腎移植后功能恢復(fù)延遲或病人發(fā)生

2、急性腎衰的重要因素。當(dāng)腎臟發(fā)生缺血再灌注時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧族(reac-tive oxygen species，ROS)，使腎臟處于高度氧化應(yīng)激狀態(tài)，這也是缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一。ROS包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH-)和過氧化氫(H2O2)等。ROS化學(xué)性質(zhì)非?；顫姡梢云茐募?xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、DNA和脂類等生物大分子，從而影響細(xì)胞功能，甚至引起細(xì)胞和組織死亡。
　　Peroxiredoxin(Prx)是近幾年發(fā)現(xiàn)

3、的一類過氧化物酶系，PrxⅥ是其家族成員之一。PrxⅥ在哺乳動(dòng)物肺部尤其是肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞表達(dá)非常豐富。研究表明:PrxⅥ具有谷胱甘肽過氧化物酶的生物活性，其功能主要是負(fù)責(zé)還原H2O2和磷脂過氧化物等。用高濃度氧、百草枯、H2O2等物質(zhì)處理大鼠肺上皮細(xì)胞引起氧化應(yīng)激反應(yīng)后，PrxⅥ的mRNA和蛋白水平會(huì)明顯增強(qiáng)。當(dāng)誘導(dǎo)PrxⅥ在肺上皮細(xì)胞系過表達(dá)時(shí)，能明顯增強(qiáng)細(xì)胞分解H2O2的能力，抑制細(xì)胞過氧化反應(yīng)的發(fā)生。PrxⅥ基因敲除小鼠肺組織內(nèi)

4、H2O2和MDA含量明顯高于對(duì)照組。以上這些說明PrxⅥ在肺組織內(nèi)具有較強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激功能，在清除ROS防止肺組織過氧化損傷中可能發(fā)揮重要作用。肺臟是機(jī)體內(nèi)對(duì)氧含量非常敏感的臟器之一。當(dāng)RIRI發(fā)生時(shí)，肺臟是否也會(huì)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，遭受過氧化損傷？PrxⅥ的表達(dá)水平如何改變？未見報(bào)道。
　　本研究通過采用無損傷動(dòng)脈夾鉗夾腎動(dòng)脈法建立大鼠腎缺血再灌注損傷模型。24小時(shí)后觀察肺組織內(nèi)MDA含量、H2O2含量，以及PrxⅥ基因水平和蛋白

5、水平的表達(dá)變化，探討腎臟缺血再灌注損傷時(shí)肺組織的過氧化損傷程度，以及PrxⅥ在缺血再灌注損傷過程中的抗氧化作用，為防治RIRI引起的肺組織損傷提供一條新思路。
　　目的:觀察大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型肺內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)和抗氧化酶PrxⅥ基因和蛋白水平的表達(dá)變化，探討PrxⅥ在RIRI誘發(fā)的肺組織過氧化損傷中的作用。
　　方法:
　　1腎臟缺血再灌注損傷模型的制備及取材
　　雄性Wistar大鼠12只，體重200±

6、10 g，購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為對(duì)照組(Control)和腎臟缺血再灌注損傷組(RIRI)，每組各6只。用6％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（5ml/kg），參照余曉東等人的方法制備腎臟缺血再灌注損傷模型。RIRI組大鼠開腹后暴露其雙側(cè)腎臟，先切除右腎，然后鈍性分離左腎動(dòng)脈，在靠近腎門處用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎動(dòng)脈，觀察腎臟由鮮紅色逐漸變?yōu)榘导t色。45 mins后松開動(dòng)脈夾，恢復(fù)血液供應(yīng)，肉眼可見腎動(dòng)脈充盈，腎臟由暗紅色迅速變?yōu)轷r

7、紅色，表明再灌注成功。對(duì)照組大鼠開腹后只切除右腎，分離左腎動(dòng)脈，但不夾閉左腎動(dòng)脈。24小時(shí)后收集血液，3000rpm離心10min，分離血清用于肌酐(Serum Creatinine，SCr)、血尿素氮(Blood Urea Nitrogen，BUN)濃度測定;處死大鼠取腎臟和肺臟，將腎臟于4％多聚甲醛中固定進(jìn)行HE染色，觀察腎臟的形態(tài)學(xué)改變。將肺臟置于液氮中用于PrxⅥ mRNA和蛋白水平測定以及丙二醛(malondialdehyde

8、，MDA)和H2O2含量測定。
　　2測定指標(biāo)及方法
　　2.1血清SCr和BUN水平測定
　　血清SCr濃度采用苦味酸法測定;血清BUN濃度采用酶偶聯(lián)速率法測定。
　　2.2 HE染色觀察大鼠腎臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)
　　腎臟組織經(jīng)常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋后，切片厚約5μm，蘇木精伊紅染色，日本產(chǎn)Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟的形態(tài)變化并進(jìn)行圖象分析。
　　2.3大鼠肺組織MDA含量測定
　　將從-

9、70℃冰箱中取出的肺組織按照10mg/100μl加入預(yù)冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液，PH7.4，1mmol/L鹽酸苯甲脒，1mmol/LPMSF,0.1％Tween-20,0.5mol/LNaCl,1mmol/LEDTANa3,5mmol/Lβ-巰基乙醇），冰浴中勻漿，勻漿液4000rpm4℃離心20min，取上清即制成10％肺組織勻漿，肺組織勻漿內(nèi)MDA含量采用南京建成丙二醛(MDA)測定試劑盒測定。
　　2.4

10、大鼠肺組織H2O2含量測定
　　將從-70℃冰箱中取出的肺組織按照10mg/100μ l加入預(yù)冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液，PH7.4，1mmol/L鹽酸苯甲脒，1mmol/LPMSF,0.1％Tween-20,0.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巰基乙醇），冰浴中勻漿，勻漿液4000rpm4℃C離心20min，取上清即制成10％肺組織勻漿。肺組織勻漿內(nèi)H2O2含量采用鉬酸

11、比色法測定，以每克樣本蛋白所含的過氧化氫的量(mmol/g pro)表示。
　　2.5大鼠肺組織PrxⅥ mRNA水平測定
　　用TRIzol法提取肺內(nèi)總RNA。約3μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)對(duì)照，進(jìn)行RT-PCR。分別以PrxⅥ的擴(kuò)增產(chǎn)物與GAPDH灰度值之比表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量
　　2.6大鼠肺組織PrxⅥ蛋白水平測定
　　采用Western blot法測定大鼠肺組織PrxⅥ蛋白水平。

12、將大鼠肺組織制成勻漿，離心后取上清。用改良Lowry法進(jìn)行蛋白總量測定.電泳的蛋白上樣量為64 ug.經(jīng)過轉(zhuǎn)膜和封閉處理后，在PVDF膜上加入兔抗PrxⅥ抗體，室溫靜置過夜。再加入熒光標(biāo)記的抗兔IgG抗體.在雙色紅外線成像系統(tǒng)掃描照相并進(jìn)行圖像數(shù)值分析。
　　結(jié)果:
　　1大鼠腎組織的形態(tài)學(xué)改變
　　光學(xué)顯微鏡下可見正常組大鼠腎血管球、腎小囊、近曲、遠(yuǎn)曲小管及集合管形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰規(guī)整。而RIRI組大鼠可見腎血管球萎縮，體

13、積變小;腎小囊腔擴(kuò)張;腎小管管腔明顯擴(kuò)張，個(gè)別近曲小管上皮細(xì)胞水腫，胞漿疏松化;腎間質(zhì)水腫，腎小管間隙擴(kuò)大;集合管出現(xiàn)管腔擴(kuò)張、上皮水腫等改變。
　　2血清SCr水平
　　Con組大鼠血清中SCr的濃度為103.444±8.465μmol/L，而RIRI組血清SCr的濃度為131.153±17.814μmol/L。RIRI組大鼠血清SCr濃度明顯高于Con組(P＜0.05)。
　　3血清BUN水平
　　Con組大

14、鼠血清BUN的濃度為4.462±0.541 mmol/L，而RIRI組血清BUN的濃度為13.685±4.397 mmol/L。RIRI組大鼠血清BUN的濃度明顯高于Con組(P＜0.05)。
　　4肺勻漿內(nèi)MDA的含量
　　Con組大鼠肺勻漿內(nèi)的MDA含量為7.63±1.68mmol/g，而RIRI組肺勻漿內(nèi)的MDA含量為10.89±1.74 mmol/g。RIRI組大鼠肺勻漿內(nèi)的MDA含量明顯高于Con組(P＜0.01)

15、。
　　5肺勻漿內(nèi)H2O2的含量
　　Con組大鼠肺勻漿內(nèi)的H2O2含量為16.51±2.39mmol/g，而RIRI組肺勻漿內(nèi)的H2O2含量為21.85±4.16 mmol/g。RIRI組大鼠肺勻漿內(nèi)的H2O2含量明顯高于Con組（P＜0.05）。
　　6肺組織PrxⅥ mRNA的相對(duì)表達(dá)量
　　采用RT-PCR的方法測定大鼠肺組織內(nèi)PrxⅥ mRNA的相對(duì)表達(dá)量。Con組肺組織內(nèi)PrxⅥ mRNA的相對(duì)表達(dá)量

16、為0.72±0.17，RIRI肺組織內(nèi)PrxⅥ mRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.09±0.23，RIRI組大鼠肺組織內(nèi)PrxⅥmRNA水平明顯高于Con組(P＜0.01)。說明RIRI組大鼠肺組織內(nèi)PrxⅥ的基因表達(dá)水平升高。
　　7大鼠肺組織PrxⅥ蛋白水平
　　Con組大鼠肺組織內(nèi)PrxⅥ的蛋白表達(dá)水平為0.62±0.13，RIRI組大鼠肺組織內(nèi)PrxⅥ的蛋白表達(dá)水平為0.88±0.16。RIRI組PrxⅥ蛋白水平明顯高于對(duì)照