PrxVI在大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型肺內(nèi)的表達(dá)變化.pdf

1、肝臟是機(jī)體內(nèi)重要的代謝器官，不僅參與蛋白質(zhì)、脂肪等重要物質(zhì)代謝，還具有排泄、分泌、解毒等功能。因此，肝功能發(fā)生異常不僅會(huì)導(dǎo)致代謝紊亂還會(huì)引起其他重要器官的功能受損。肝臟的缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI)是肝臟外科手術(shù)如肝臟移植、肝部分切除等過程中經(jīng)常遇到的病理生理現(xiàn)象。有研究表明:HIRI的發(fā)生是導(dǎo)致肝功能衰竭，手術(shù)失敗，病人愈后較差的重要原因。
　　HIRI的主要

2、損傷機(jī)制為缺血再灌注時(shí)產(chǎn)生的大量活性氧族(reactiveoxygen species:ROS)對(duì)肝臟組織細(xì)胞的過氧化損害。ROS主要包括超氧陰離子（O2-·），過氧化氫(H2O2)和羥自由基(OH.)等。ROS的化學(xué)性質(zhì)非常活潑，可以與細(xì)胞內(nèi)和胞膜的重要結(jié)構(gòu)蛋白、功能蛋白發(fā)生過氧化反應(yīng)，改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞功能，甚至引起細(xì)胞和組織死亡。肺臟是機(jī)體內(nèi)對(duì)氧含量非常敏感的臟器之一，當(dāng)HIRI發(fā)生時(shí)，是否會(huì)引起遠(yuǎn)端臟器肺臟也處于氧化應(yīng)激

3、狀態(tài)，遭受過氧化損傷？
　　PrxⅥ是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類過氧化物酶系Peroxiredoxin(Prx)的家族成員之一。PrxⅥ在哺乳動(dòng)物肺部尤其是肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞表達(dá)非常豐富。研究表明:PrxⅥ具有谷胱甘肽過氧化物酶的生物活性，其功能主要是負(fù)責(zé)還原H2O2和磷脂過氧化物等。用高濃度氧、百草枯、H2O2等物質(zhì)處理大鼠肺上皮細(xì)胞引起氧化應(yīng)激反應(yīng)后，PrxⅥ的mRNA和蛋白水平會(huì)明顯增強(qiáng)。當(dāng)誘導(dǎo)PrxⅥ在肺上皮細(xì)胞系過表達(dá)時(shí)，能明顯增強(qiáng)

4、細(xì)胞分解H2O2的能力，抑制細(xì)胞過氧化反應(yīng)的發(fā)生。說明:PrxⅥ在清除ROS，防止肺組織過氧化損傷中可能發(fā)揮重要作用。當(dāng)肝臟缺血再灌注損傷發(fā)生后，PrxⅥ的表達(dá)水平如何改變？未見報(bào)道。
　　本研究通過無損傷血管夾夾閉通往大鼠肝左葉、肝中葉的血管和膽管蒂30 min后松開血管夾，制造大鼠70％肝臟缺血再灌注損傷模型，然后觀察大鼠肺內(nèi)MDA水平，PrxⅥ的mRNA和蛋白表達(dá)水平。探討肝臟缺血再灌注損傷后肺內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)以及PrxⅥ的

5、抗氧化作用
　　目的:觀察大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型肺內(nèi)的氧化應(yīng)激水平以及PrxⅥ mRNA和蛋白表達(dá)水平的改變，探討其在肺內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮的作用。
　　方法:
　　1、肝臟缺血再灌注損傷模型的制備及取材
　　選用健康雄性Wistar大鼠，體重200±10g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為對(duì)照組(Con)和缺血再灌注損傷組(HIRI)，用6％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.5ml/kg)，參照Kohl

6、i等人的方法，分離肝血管和膽管蒂，以無創(chuàng)傷性血管夾夾閉通往肝左葉、肝中葉的血管和膽管蒂。30分鐘后去掉血管夾，恢復(fù)肝臟血液供應(yīng)，制造70％肝實(shí)質(zhì)的肝臟缺血再灌注損傷模型。對(duì)照組大鼠只分離血管和膽管蒂并不夾閉。6小時(shí)后收集血液，用于ALT（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）測定;處死大鼠取肝臟和肺，肝臟于4％多聚甲醛中固定進(jìn)行HE染色，觀察肝組織的形態(tài)學(xué)改變，肺組織置于液氮中用于PrxⅥ mRNA水平、蛋白水平測定以及MDA含量測定。
　　2、測定

7、指標(biāo)及方法
　　2.1 HE染色觀察大鼠肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)
　　肝組織經(jīng)常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋后，切片厚約5μm，蘇木精伊紅染色，日本產(chǎn)Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)變化并進(jìn)行圖象分析。
　　2.2血清ALT水平測定
　　未抗凝血經(jīng)3000rpm離心10min分離血清，血清ALT水平由全自動(dòng)生化分析儀測定。
　　2.3肺勻漿的制備和MDA含量測定
　　從-70℃冰箱中取出肺組織，按照10mg/1

8、00μ l加入預(yù)冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液，PH7.4，1mmol/L鹽酸苯甲脒，1mmol/L PMSF，0.1％Tween-20,0.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巰基乙醇），冰浴中勻漿，勻漿液4000rpm4℃離心20min，取上清即制成10％肺組織勻漿，肺組織勻漿內(nèi)MDA含量經(jīng)南京建成丙二醛(MDA)測定試劑盒測定
　　2.4大鼠肺組織PrxⅥ mRNA水平測定

9、
　　用TRIzol法提取肺內(nèi)總RNA。約3μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)對(duì)照，進(jìn)行RT-PCR。分別以PrxⅥ的擴(kuò)增產(chǎn)物與GAPDH灰度值之比表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量
　　2.5大鼠肺組織內(nèi)PrxⅥ蛋白水平測定
　　采用Western blot法測定大鼠肺內(nèi)PrxⅥ蛋白水平。將大鼠肺組織制成勻漿，離心后取上清。用改良Lowry法進(jìn)行蛋白總量測定.電泳的蛋白上樣量為61ug.經(jīng)過轉(zhuǎn)膜和封閉處理后，在PV

10、DF膜上加入兔抗PrxⅥ抗體，室溫靜置過夜。再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔IgG抗體.按發(fā)光試劑操作說明進(jìn)行顯影，定影，晾干。用凝膠成像系統(tǒng)掃描膠片并分析圖像，以條帶的積分光密度值表示其蛋白含量
　　結(jié)果:
　　1、大鼠肝組織的形態(tài)學(xué)改變
　　光學(xué)顯微鏡下可見Con組大鼠肝細(xì)胞排列成條索狀，圍繞中央靜脈成放射狀排列，肝索間肝血竇大小均勻，無明顯擴(kuò)張充血。而HIRI組大鼠的肝組織淤血嚴(yán)重，肝血竇明顯擴(kuò)張充血，肝細(xì)胞受壓萎縮

11、，肝細(xì)胞胞漿染色變淺且有空泡出現(xiàn)，部分肝細(xì)胞水腫明顯，體積增大，染色變淺。
　　2、血清ALT水平
　　Con組大鼠血清中ALT為20.03±5.23U/L，而HIRI組血清ALT為87.43±9.06 U/L。HIRI組大鼠血清ALT水平明顯高于Con組(P＜0.01)。
　　3、肺勻漿內(nèi)MDA的含量
　　Con組大鼠肺內(nèi)MDA的含量為9.81±1.89mmol/g，而HIRI組MDA含量為14.09±2.47

12、 mmol/g。HIRI組大鼠肺內(nèi)MDA的含量明顯高于Con組（P＜0.01）
　　4、肺組織PrxⅥ mRNA相對(duì)表達(dá)量
　　采用RT-PCR的方法測定大鼠肺組織內(nèi)抗氧化酶PrxⅥ mRNA的表達(dá)量。計(jì)算與內(nèi)參照的比值得出相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。分析表明:HIRI組大鼠肺組織內(nèi)的PrxⅥ mRNA水平均明顯高于Con組(P＜0.01)。說明HIRI組大鼠肺組織內(nèi)PrxⅥ表達(dá)升高。
　　5、大鼠肺組織內(nèi)PrxⅥ的蛋白水