PrxVI、SOD、CAT在大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型腦內(nèi)的表達(dá)變化.pdf

1、肝臟不僅參與物質(zhì)代謝，還具有分泌、排泄、解毒等重要功能。因此，肝臟功能發(fā)生異常還會(huì)導(dǎo)致其他重要器官的代謝和功能受損如肝性腦病、肝腎綜合征等。肝臟的缺血再灌注損傷（hepatic ischemia reperfusioninjury，HIRI）是目前臨床上經(jīng)常遇到的一個(gè)棘手問題。有研究表明它不僅是導(dǎo)致肝功能衰竭，病人愈后較差的重要原因，還可使遠(yuǎn)端器官如心臟處于高度氧化應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞遭受過氧化損傷。
　　 氧化應(yīng)激損傷是由活

2、性氧族(reactive oxygen species:ROS)造成的。ROS包括超氧陰離子(O2-.)，過氧化氫(H2O2)和羥自由基(OH.)。因其化學(xué)性質(zhì)非?；顫姡梢云茐募?xì)胞內(nèi)的重要結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，并能改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，從而影響細(xì)胞功能，甚至引起細(xì)胞和組織死亡。PrxⅥ是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類過氧化物酶系Peroxiredoxin(Prx)的家族成員之一。它在多種組織表達(dá)，其中肺和腦表達(dá)最多。研究表明PrxⅥ具有谷胱甘肽過氧化物酶

3、的生物活性，其功能主要是負(fù)責(zé)還原H2O2和磷脂過氧化物等。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutases，SOD)、過氧化氫酶(Catalases，CAT)也是機(jī)體內(nèi)清除ROS的重要酶系，SOD能夠清除O2-.，而CAT主要負(fù)責(zé)清除脂類代謝過程中產(chǎn)生的H2O2。
　　 腦組織和心肌都是機(jī)體內(nèi)對(duì)氧含量高度敏感的器官，當(dāng)肝臟缺血再灌注損傷發(fā)生后，腦組織是否也會(huì)受到氧化應(yīng)激損傷？PrxⅥ、SOD和CAT等抗氧化酶的基因水平

4、如何改變？未見報(bào)道。
　　 本研究通過無損傷血管夾夾閉通往大鼠肝左葉、肝中葉的血管和膽管蒂30 min后松開血管夾，制造大鼠70％肝臟缺血再灌注損傷模型，然后觀察大鼠腦內(nèi)MDA水平，PrxⅥ的mRNA和蛋白表達(dá)水平、SOD和CAT的mRNA表達(dá)水平及活性改變，探討肝臟缺血再灌注損傷后腦內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)以及PrxⅥ、SOD和CAT的抗氧化作用。
　　 目的:
　　 觀察大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型腦內(nèi)的氧化應(yīng)激水平以

5、及PrxⅥ、SOD和CAT抗氧化體系的表達(dá)及活性改變，探討其在腦內(nèi)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用。
　　 方法:
　　 1.肝臟缺血再灌注損傷模型的制備及取材選用健康雄性Wistar大鼠，體重200±10g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為對(duì)照組(Con)和缺血再灌注損傷組(HIPI)，用6％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（0.5ml/kg），參照Kohli等人的方法，分離肝血管和膽管蒂，以無創(chuàng)傷性血管夾夾閉通往肝左葉、肝中葉

6、的血管和膽管蒂。30分鐘后去掉血管夾，恢復(fù)肝臟血液供應(yīng)，制造70％肝實(shí)質(zhì)的肝臟缺血再灌注損傷模型。對(duì)照組大鼠只分離血管和膽管蒂并不夾閉。6小時(shí)后收集血液，用于ALT（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）測(cè)定;處死大鼠取肝臟和腦，一部分4％多聚甲醛中固定進(jìn)行HE染色，觀察肝組織和腦組織的形態(tài)學(xué)改變，一部分置于液氮中用于腦組織PrxⅥ、SOD和CAT mRNA水平、蛋白水平、抗氧化活性和MDA含量測(cè)定。
　　 2.測(cè)定指標(biāo)及方法
　　 2.1

7、 HE染色觀察大鼠肝臟和腦組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)肝臟和腦組織經(jīng)常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋后，切片厚約5μm，蘇木精伊紅染色，日本產(chǎn)Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織和腦組織形態(tài)變化并進(jìn)行圖象分析。
　　 2.2 血清ALT水平測(cè)定未抗凝血經(jīng)3000rpm離心10min分離血清，血清ALT水平由全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。
　　 2.3 腦勻漿的制備和MDA含量測(cè)定從-70℃冰箱中取出腦組織，按照10mg/100μl加入預(yù)冷的勻漿緩沖液

8、(50mmol/L磷酸鉀緩沖液，PH7.4，lmmol/L鹽酸苯甲脒，1mmol/L PMSF，0.1％Tween-20,0.5mol/LNaCl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巰基乙醇），冰浴中勻漿，勻漿液4000rpm4℃離心20min，取上清即制成10％腦組織勻漿，腦組織勻漿內(nèi)MDA含量經(jīng)南京建成丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒測(cè)定。
　　 2.4 大鼠腦組織PrxⅥ、SOD和CATmRNA水平測(cè)定用TRIz

9、ol法提取腦內(nèi)總RNA。約3μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)對(duì)照，進(jìn)行RT-PCR。分別以PrxⅥ、SOD、CAT的擴(kuò)增產(chǎn)物與GAPDH灰度值之比表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量
　　 2.5 腦組織內(nèi)CAT和SOD的活性測(cè)定CAT活性參照Aebi H的方法測(cè)定，SOD的活性采用南京建成生物公司試劑盒測(cè)定。CAT和SOD的活性均以每毫克樣本蛋白所含的酶活性單位數(shù)(U/mg pro)表示，蛋白定量采用改良的Lowry法。

10、r>　　 2.6 腦組織內(nèi)PrxⅥ蛋白水平測(cè)定采用Western blot法測(cè)定大鼠腦內(nèi)PrxⅥ蛋白水平。將大鼠腦組織制成勻漿，離心后取上清。用改良Lowry法進(jìn)行蛋白總量測(cè)定，電泳的蛋白上樣量為68 ug.經(jīng)過轉(zhuǎn)膜和封閉處理后，在PVDF膜上加入兔抗PrxⅥ抗體，室溫靜置過夜。再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔IgG抗體.按發(fā)光試劑操作說明進(jìn)行顯影，定影，晾干。用凝膠成像系統(tǒng)掃描膠片并分析圖像，以條帶的積分光密度值表示其蛋白含量。

11、　　 結(jié)果:
　　 1.大鼠肝組織和腦組織的形態(tài)學(xué)改變光學(xué)顯微鏡下可見Con組大鼠肝細(xì)胞排列成條索狀，圍繞中央靜脈成放射狀排列，肝索間肝血竇大小均勻，無明顯擴(kuò)張充血。而HIRI組大鼠的肝組織淤血嚴(yán)重，肝血竇明顯擴(kuò)張充血，肝細(xì)胞受壓萎縮，肝細(xì)胞胞漿染色變淺且有空泡出現(xiàn)，部分肝細(xì)胞水腫明顯，體積增大，染色變淺。腦組織在光學(xué)顯微鏡下兩組間未見明顯形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。
　　 2.血清ALT水平Con組大鼠血清中ALT為20.03±5

12、.23U/L，而HIRI組血清ALT為87.43±9.06 U/L。HIRI組大鼠血清ALT水平明顯高于Con組(P＜0.01)。
　　 3.腦勻漿內(nèi)MDA的含量Con組大鼠腦內(nèi)MDA的含量為7.07±1.24mmol/g，而HIRI組血清MDA含量為12.37±2.13mmol/g。HIRI組大鼠腦內(nèi)MDA的含量明顯高于Con組（P＜0.01）
　　 4.腦組織PrxⅥ、SOD、CAT mRNA相對(duì)表達(dá)量采用RT-PC

13、R的方法測(cè)定大鼠腦組織內(nèi)PrxⅥ、SOD、CAT抗氧化酶系mRNA的表達(dá)量。計(jì)算與內(nèi)參照的比值得出相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。分析表明:HIRI組大鼠腦組織內(nèi)的PrxⅥ、SOD、CAT的mRNA水平均明顯高于Con組（P＜0.05）。說明HIRI組大鼠腦組織內(nèi)PrxⅥ、SOD、CAT抗氧化酶系表達(dá)升高。
　　 5.大鼠腦組織內(nèi)SOD和CAT活性Con組大鼠腦組織內(nèi)SOD和CAT活性分別為228.07±22.4U/mg pro和28.

14、5±1.61 U/mg pro，HIRI組分別為323.22±21.4U/mg pro和49.16±5.13U/mg pro。HIRI組大鼠腦組織內(nèi)SOD和CAT活性明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）
　　 6.大鼠腦組織內(nèi)PrxⅥ的蛋白水平HIRI組大鼠腦組織內(nèi)PrxⅥ的蛋白表達(dá)水平（1.37±0.16）明顯高于對(duì)照組（0.79±0.12）(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.結(jié)扎肝左、中血管和膽管蒂可成功建