PrxⅢ在大鼠腎缺血再灌注損傷模型心肌內(nèi)的表達(dá)變化.pdf

1、腎臟是機(jī)體內(nèi)重要的排泄與分泌器官，對(duì)維持機(jī)體酸堿平衡以及鉀、鈉、鈣等電解質(zhì)的穩(wěn)定具有重要作用。因此，腎臟對(duì)維持機(jī)體整個(gè)內(nèi)環(huán)境的平衡穩(wěn)定具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)腎臟功能被損害時(shí)，其遠(yuǎn)端或鄰近器官如肝、肺、心、腦和腸等的功能也會(huì)同時(shí)受損。
　　腎缺血再灌注損傷( Renal ischemia reperfusion injury, RIRI)是臨床上一種常見(jiàn)的病理生理反應(yīng)，常見(jiàn)于腎臟移植或急性腎動(dòng)脈阻斷等臨床治療過(guò)程中。RIRI也是

2、導(dǎo)致腎移植病人術(shù)后功能恢復(fù)延遲，甚至發(fā)生急性腎衰增加患者死亡率的重要因素。在到達(dá)腎臟的血流被暫時(shí)性阻斷，隨后又恢復(fù)其血液供應(yīng)重新充氧的過(guò)程中，會(huì)有大量的活性氧族(reac-tive oxygen species, ROS)產(chǎn)生，導(dǎo)致腎臟處于高度氧化應(yīng)激狀態(tài)。這也是引發(fā)缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一。ROS的成員主要包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH-)和過(guò)氧化氫(H2O2)等。ROS的化學(xué)性質(zhì)非?；顫?，可以與細(xì)胞內(nèi)的功能蛋白質(zhì)、DN

3、A和胞膜上的脂類等生物大分子發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和死亡，加劇腎臟組織損傷。
　　Peroxiredoxin（Prx）是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類能清除ROS的過(guò)氧化物酶系。Prx Ⅲ是Prx家族成員之一，也是整個(gè)家族中唯一的特異性定位于線粒體的酶蛋白。研究發(fā)現(xiàn)：Prx Ⅲ產(chǎn)生于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，然后依靠定位信號(hào)定位于線粒體。線粒體是細(xì)胞內(nèi)ROS的主要產(chǎn)生來(lái)源，同時(shí)它自身也是ROS的主要攻擊靶點(diǎn)。近些年的研究發(fā)現(xiàn)：Prx Ⅲ與細(xì)胞線粒體內(nèi)H

4、2O2的清除有密切關(guān)系。Prx Ⅲ可能是線粒體內(nèi)ROS的重要清除者。
　　心臟是機(jī)體內(nèi)需氧量大、對(duì)缺血缺氧反應(yīng)極為敏感的臟器之一。線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP是心肌細(xì)胞的主要能量來(lái)源。在此過(guò)程中會(huì)有大量電子從呼吸鏈泄露出來(lái)從而形成ROS。因此，心臟是機(jī)體內(nèi)最容易受到ROS攻擊遭受過(guò)氧化損傷的器官。在腎缺血再灌注損傷發(fā)生后，腎臟處于高度氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，心臟此時(shí)是否也會(huì)發(fā)生過(guò)氧化損傷，氧化應(yīng)激是否也是引起心肌損傷的主要機(jī)制之一？心肌組

5、織Prx Ⅲ的表達(dá)如何變化，是否參與此氧化應(yīng)激過(guò)程？未見(jiàn)報(bào)道。
　　本研究采用無(wú)損傷動(dòng)脈夾鉗夾腎動(dòng)脈法建立大鼠腎缺血再灌注損傷模型。再灌注24小時(shí)后觀察心肌組織內(nèi)H2O2含量、MDA含量，以及抗氧化酶Prx Ⅲ基因水平和蛋白水平的表達(dá)變化，探討腎臟缺血再灌注損傷誘發(fā)心肌組織損傷的氧化應(yīng)激機(jī)制，以及Prx Ⅲ在缺血再灌注損傷過(guò)程中的抗氧化作用，為防治腎缺血再灌注引起的心肌組織損傷提供一條新思路。
　　目的：
　　觀察大鼠

6、腎臟缺血再灌注損傷發(fā)生后心肌組織是否也處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，以及抗氧化酶Prx Ⅲ的基因水平和蛋白水平的表達(dá)變化，探討腎臟缺血再灌注損傷誘發(fā)心肌損傷的氧化應(yīng)激機(jī)制，以及Prx Ⅲ在此過(guò)程中可能發(fā)揮的抗氧化作用。
　　方法：
　　1、腎臟缺血再灌注損傷模型的制備及取材
　　雄性Wister大鼠12只，體重200±10 g，購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為對(duì)照組（Control）和腎臟缺血再灌注損傷組(RIRI)，每組各

7、6只。用6％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（5ml／kg），參照余曉東等人的方法制備腎臟缺血再灌注損傷模型。RIRI組大鼠開(kāi)腹后暴露其雙側(cè)腎臟,先切除右腎,然后鈍性分離左腎動(dòng)脈,在靠近腎門處用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎動(dòng)脈,觀察腎臟由鮮紅色逐漸變?yōu)榘导t色。45 mins后松開(kāi)動(dòng)脈夾,恢復(fù)血液供應(yīng),肉眼可見(jiàn)腎動(dòng)脈充盈,腎臟由暗紅色迅速變?yōu)轷r紅色,表明再灌注成功。對(duì)照組大鼠開(kāi)腹后只切除右腎,分離左腎動(dòng)脈,但不夾閉左腎動(dòng)脈。24小時(shí)后收集血液，3000rp

8、m離心10min,分離血清用于肌酐（Serum Creatinine，SCr）、血尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）濃度測(cè)定;處死大鼠取腎臟和心臟，將腎臟于4%多聚甲醛中固定進(jìn)行HE染色,觀察腎臟的形態(tài)學(xué)改變。將心臟置于液氮中用于Prx Ⅲ mRNA和蛋白水平測(cè)定以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）和H2O2含量測(cè)定。
　　2、測(cè)定指標(biāo)及方法
　　2.1、血清SCr和BUN水平測(cè)定

9、>　　血清SCr濃度采用苦味酸法測(cè)定；血清BUN濃度采用酶偶聯(lián)速率法測(cè)定。
　　2.2、 HE染色觀察大鼠腎臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)
　　腎臟組織經(jīng)常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋后，切片厚約5μm，蘇木精伊紅染色，日本產(chǎn) Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟的形態(tài)變化并進(jìn)行圖象分析。
　　2.3、大鼠心肌組織MDA含量測(cè)定
　　將從-70℃冰箱中取出的心肌組織按照10mg/100μl加入預(yù)冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液

10、，PH7.4，1mmol/L鹽酸苯甲脒，1mmol/L PMSF，0.1%Tween-20，0.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTANa3，5mmol/Lβ-巰基乙醇)，冰浴中勻漿，勻漿液4000rpm4℃離心20min，取上清即制成10％心肌組織勻漿，勻漿內(nèi)MDA含量采用南京建成丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒測(cè)定。
　　2.4、大鼠心肌組織H2O2含量測(cè)定
　　將從-70℃冰箱中取出的心肌組織按照10mg/100μ

11、l加入預(yù)冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液，PH7.4，1mmol/L鹽酸苯甲脒，1mmol/L PMSF，0.1%Tween-20，0.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTANa3，5mmol/Lβ-巰基乙醇)，冰浴中勻漿，勻漿液4000rpm4℃離心20min，取上清即制成10％心肌組織勻漿。勻漿內(nèi)H2O2含量采用鉬酸比色法測(cè)定，以每克樣本蛋白所含的過(guò)氧化氫的量(mmol/g pro)表示。
　　2.5、大

12、鼠心肌組織Prx Ⅲ mRNA水平測(cè)定
　　用TRIzol法提取心肌總RNA。約3μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)對(duì)照，進(jìn)行 RT-PCR。分別以 PrxIII的擴(kuò)增產(chǎn)物與 GAPDH灰度值之比表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量
　　2.6、大鼠心肌組織Prx Ⅲ蛋白水平測(cè)定
　　采用Western blot法測(cè)定大鼠心肌組織內(nèi)抗氧化酶Prx Ⅲ的蛋白表達(dá)水平。將大鼠心肌組織制成勻漿,離心后取上清。采用改良Lowr

13、y法測(cè)定其蛋白總量.電泳的蛋白上樣量為62 ug.經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)膜及封閉處理后,在PVDF膜上加入兔抗Prx Ⅲ抗體,室溫靜置過(guò)夜。經(jīng)洗膜后再加入熒光標(biāo)記的抗兔IgG二抗。經(jīng)雙色紅外線成像系統(tǒng)掃描照相并進(jìn)行圖像數(shù)值分析。
　　結(jié)果：
　　1、大鼠腎組織的形態(tài)學(xué)改變
　　光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)正常組大鼠腎血管球、腎小囊、近曲、遠(yuǎn)曲小管及集合管形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰規(guī)整。而RIRI組大鼠可見(jiàn)部分腎小球萎縮，體積變小；腎小囊腔擴(kuò)張；腎小管管腔明顯擴(kuò)

14、張；腎間質(zhì)水腫，腎小管間隙擴(kuò)大；集合管出現(xiàn)管腔擴(kuò)張等改變。
　　2、血清SCr水平
　　Con組大鼠血清中SCr的濃度為103.444±8.465μmol/L，而RIRI組血清SCr的濃度為131.153±17.814μmol/L。RIRI組大鼠血清SCr濃度明顯高于Con組（P<0.05）。
　　3、血清BUN水平
　　Con組大鼠血清BUN的濃度為4.462±0.541 mmol/L，而RIRI組血清BUN的

15、濃度為13.685±4.397 mmol/L。RIRI組大鼠血清BUN的濃度明顯高于Con組（P<0.05）。
　　4、心肌組織勻漿內(nèi)MDA的含量
　　Con組大鼠心肌組織勻漿內(nèi)的 MDA含量為10.18±1.77mmol/g，而RIRI組心肌組織勻漿內(nèi)的MDA含量為14.01±2.29 mmol/g。RIRI組大鼠心肌組織勻漿內(nèi)的MDA含量明顯高于Con組（P<0.01）。
　　5、大鼠心肌組織勻漿內(nèi)H2O2的含量<

16、br>　　Con組大鼠心肌組織勻漿內(nèi)的 H2O2含量為13.93±1.88 mmol/g，而RIRI組心肌組織勻漿內(nèi)的H2O2含量為18.56±2.56 mmol/g。RIRI組大鼠心肌組織勻漿內(nèi)的H2O2含量明顯高于Con組（P<0.01）。
　　6、大鼠心肌組織Prx Ⅲ mRNA的相對(duì)表達(dá)量
　　采用 RT-PCR的方法測(cè)定大鼠心肌組織內(nèi)Prx Ⅲ mRNA的相對(duì)表達(dá)量。Con組大鼠心肌組織內(nèi)Prx Ⅲ mRNA的相對(duì)

17、表達(dá)量為0.95±0.17，RIRI組心肌組織內(nèi)Prx Ⅲ mRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.34±0.18，RIRI組大鼠心肌組織內(nèi)Prx Ⅲ mRNA水平明顯高于Con組（P<0.01）。說(shuō)明RIRI組大鼠心肌組織內(nèi)PrxIII的基因表達(dá)水平升高。
　　7、大鼠心肌組織Prx Ⅲ蛋白水平
　　Con組大鼠心肌組織內(nèi)Prx Ⅲ的蛋白表達(dá)水平為0.58±0.09，RIRI組大鼠心肌組織內(nèi)Prx Ⅲ的蛋白表達(dá)水平為1.01±0.17。

18、RIRI組Prx Ⅲ蛋白水平明顯高于對(duì)照組（P<0.01）。說(shuō)明RIRI組大鼠心肌組織內(nèi)Prx Ⅲ的蛋白表達(dá)水平升高。
　　結(jié)論：
　　1、切除右腎后在靠近腎門處用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎動(dòng)脈可成功建立大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型。
　　2、腎臟缺血再灌注損傷發(fā)生后，心肌組織也處于高度氧化應(yīng)激狀態(tài)，并引起心肌組織的過(guò)氧化損傷。
　　3、Prx Ⅲ的基因和蛋白表達(dá)水平在RIRI模型心肌組織內(nèi)均明顯增強(qiáng)。表明Prx Ⅲ可能參