Prx6在大鼠腎缺血再灌注損傷模型腦內(nèi)的表達(dá)變化.pdf

1、腎臟不僅參與代謝廢物的排泄，還具有分泌激素，維持水電解質(zhì)以及酸堿平衡等重要功能。因此，腎臟功能發(fā)生異常必然導(dǎo)致其他重要器官的代謝和功能也隨之改變。有研究表明:當(dāng)腎臟功能受損時(shí)，其鄰近和遠(yuǎn)端器官如心、肺、肝、腸和腦等的功能也會(huì)嚴(yán)重受損。
　　腎缺血再灌注損傷(Renal ischemia reperfusion injury, RIRI)是目前臨床上經(jīng)常遇到的一個(gè)棘手問題，多見于高血壓、腎外科手術(shù)期間等，它也是導(dǎo)致腎移植術(shù)后功能恢復(fù)

2、延遲、病人愈后較差甚至腎功能衰竭的重要因素。有研究表明:氧化應(yīng)激是導(dǎo)致RIRI發(fā)生的主要病理機(jī)制之一。缺血再灌注時(shí)腎臟處于高度氧化應(yīng)激狀態(tài)，會(huì)有大量ROS產(chǎn)生。ROS包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH-)和過氧化氫(H2O2)等;ROS化學(xué)性質(zhì)非?；顫?，可以與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、DNA和脂類等生物大分子發(fā)生過氧化反應(yīng)，從而影響細(xì)胞功能，甚至引起細(xì)胞和組織死亡。
　　Peroxiredoxin(Prx)蛋白是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類過氧化

3、物酶系，廣泛存在于各種原核和真核生物細(xì)胞中。Prx6是其家族成員之一，它在多種組織表達(dá)，其中肺和腦表達(dá)最多。研究表明，Prx6具有谷胱甘肽過氧化物酶的生物活性，其功能主要是負(fù)責(zé)還原H2O2和磷脂過氧化物等。
　　腦組織是機(jī)體內(nèi)對(duì)氧含量高度敏感的器官，當(dāng)腎臟缺血再灌注損傷發(fā)生后，腦組織是否也會(huì)受到氧化應(yīng)激損傷？抗氧化酶Prx6的基因和蛋白表達(dá)水平如何改變？未見報(bào)道。
　　本研究通過采用無損傷動(dòng)脈夾鉗夾腎動(dòng)脈法建立大鼠腎缺血再灌

4、注損傷模型。24小時(shí)后觀察腦組織內(nèi)MDA含量，Prx6基因水平和蛋白水平的表達(dá)變化，探討腎臟缺血再灌注損傷時(shí)腦組織的過氧化損傷程度，Prx6在缺血再灌注損傷過程中的抗氧化作用，為防治RIRI引起的腦組織損傷提供一條新思路。
　　目的:觀察大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型腦內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)和抗氧化酶Prx6基因和蛋白水平的表達(dá)變化，探討Prx6在RIRI誘發(fā)的腦過氧化損傷中的作用。
　　方法:
　　1腎臟缺血再灌注損傷模型的制

5、備及取材
　　雄性Wister大鼠12只，體重200±10 g，購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為對(duì)照組(Control)和腎臟缺血再灌注損傷組（RIRI），每組各6只。用6％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（5ml/kg），參照余曉東等人的方法制備腎臟缺血再灌注損傷模型。RIRI組大鼠開腹后暴露其雙側(cè)腎臟，先切除右腎，然后鈍性分離左腎動(dòng)脈，在靠近腎門處用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎動(dòng)脈，觀察腎臟由鮮紅色逐漸變?yōu)榘导t色。45mins后松開動(dòng)脈夾

6、，恢復(fù)血液供應(yīng)，肉眼可見腎動(dòng)脈充盈，腎臟由暗紅色迅速變?yōu)轷r紅色，表明再灌注成功。對(duì)照組大鼠開腹后只切除右腎，分離左腎動(dòng)脈，但不夾閉左腎動(dòng)脈。24小時(shí)后收集血液，3000rpm離心10min，分離血清用于血清肌酐(Serum Creatinine，SCr)、血尿素氮(Blood UreaNitrogen，BUN)濃度測(cè)定;處死大鼠取腎臟和腦，將腎臟于4％多聚甲醛中固定進(jìn)行HE染色，觀察腎臟的形態(tài)學(xué)改變。將腦組織置于液氮中用于Prx6mRN

7、A和蛋白水平測(cè)定以及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量測(cè)定。
　　2測(cè)定指標(biāo)及方法
　　2.1血清SCr和BUN水平測(cè)定
　　血清SCr濃度采用苦味酸法測(cè)定;血清BUN濃度采用酶偶聯(lián)速率法測(cè)定。
　　2.2 HE染色觀察大鼠腎臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)
　　腎臟組織經(jīng)常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋后，切片厚約5μm，蘇木精伊紅染色，日本產(chǎn)Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟的形態(tài)變化并進(jìn)行圖象分析。
　　

8、2.3大鼠腦組織MDA含量測(cè)定
　　將從-70℃冰箱中取出的腦組織按照10mg/100μl加入預(yù)冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液，PH7.4，1mmol/L鹽酸苯甲脒，1mmol/LPMSF,0.1％Tween-20,0.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巰基乙醇），冰浴中勻漿，勻漿液4000rpm4℃離心20min，取上清即制成10％腦組織勻漿，腦組織勻漿內(nèi)MDA含量采用南京建

9、成丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒測(cè)定。
　　2.4大鼠腦組織Prx6 mRNA水平測(cè)定
　　用TRIzol法提取腦內(nèi)總RNA。約3μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)對(duì)照，進(jìn)行RT-PCR。分別以Prx6的擴(kuò)增產(chǎn)物與GAPDH灰度值之比表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量
　　2.5大鼠腦組織Prx6蛋白水平測(cè)定
　　采用Western blot法測(cè)定大鼠腦組織Prx6蛋白水平。將大鼠腦組織制成勻漿，離心后取上清。用改

10、良Lowry法進(jìn)行蛋白總量測(cè)定.電泳的蛋白上樣量為60ug.經(jīng)過轉(zhuǎn)膜和封閉處理后，在PVDF膜上加入兔抗Prx6抗體，室溫靜置過夜。再加入熒光標(biāo)記的抗兔IgG抗體.在雙色紅外線成像系統(tǒng)掃描照相并進(jìn)行圖像數(shù)值分析。
　　結(jié)果:
　　1大鼠腎組織的形態(tài)學(xué)改變
　　光學(xué)顯微鏡下可見正常組大鼠腎血管球、腎小囊、近曲、遠(yuǎn)曲小管及集合管形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰規(guī)整。而RIRI組大鼠可見腎血管球萎縮，體積變小;腎小囊腔擴(kuò)張;腎小管管腔明顯擴(kuò)張，

11、個(gè)別近曲小管上皮細(xì)胞水腫，胞漿疏松化;腎間質(zhì)水腫，腎小管間隙擴(kuò)大;集合管出現(xiàn)管腔擴(kuò)張、上皮水腫等改變。
　　2血清SCr水平
　　Con組大鼠血清中SCr的濃度為103.444±8.465μmol/L，而RIRI組血清SCr的濃度為131.153±17.814μmol/L。RIRI組大鼠血清SCr濃度明顯高于Con組(P＜0.05)。
　　3血清BUN水平
　　Con組大鼠血清BUN的濃度為4.462±0.541

12、 mmol/L，而RIRI組血清BUN的濃度為13.685±4.397 mmol/L。RIRI組大鼠血清BUN的濃度明顯高于Con組(P＜0.05)。
　　4腦勻漿內(nèi)MDA的含量
　　Con組大鼠腦勻漿內(nèi)的MDA含量為7.67±1.77mmol/g，而RIRI組腦勻漿內(nèi)的MDA含量為11.67±2.33 mmol/g。RIRI組大鼠腦勻漿內(nèi)的MDA含量明顯高于Con組(P＜0.01)。
　　5腦組織Prx6 mRNA的

13、相對(duì)表達(dá)量
　　采用RT-PCR的方法測(cè)定大鼠腦組織內(nèi)Prx6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。Con組腦組織內(nèi)Prx6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.69±0.16，RIRI腦組織內(nèi)Prx6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.08±0.19，RIRI組大鼠腦組織內(nèi)Prx6mRNA水平明顯高于Con組（P＜0.01）。說明RIRI組大鼠腦組織內(nèi)Prx6的基因表達(dá)水平升高。
　　6大鼠腦組織Prx6蛋白水平
　　Con組大鼠腦組織內(nèi)Prx6的

14、蛋白表達(dá)水平為0.73±0.13，RIRI組大鼠腦組織內(nèi)Prx6的蛋白表達(dá)水平為1.12±0.19。RIRI組Prx6蛋白水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。說明RIRI組大鼠腦組織內(nèi)Prx6的蛋白表達(dá)水平升高。
　　結(jié)論:
　　1切除右腎后在靠近腎門處用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎動(dòng)脈可成功建立大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型。
　　2腎臟缺血再灌注損傷可使遠(yuǎn)端器官腦組織遭受氧化應(yīng)激損傷，同時(shí)抗氧化酶Prx6的基因和蛋白表達(dá)水平明顯