β-cat在小鼠肝臟缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用及機(jī)制的研究.pdf

1、缺血再灌注損傷(IschemiaRcperfusionInjury，IRI)是外科手術(shù)過(guò)程中常見(jiàn)的、多種因素參與的病理生理過(guò)程。IRI可損傷細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，引起一系列的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞水腫，并造成器官功能損傷，甚至引發(fā)死亡。肝臟IRI是一個(gè)多分子、多因素參與的病理過(guò)程，常見(jiàn)于肝臟移植、嚴(yán)重的肝臟外傷處理、肝臟腫瘤切除等臨床肝臟外科手術(shù)治療過(guò)程。鑒于其具體發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，而病理轉(zhuǎn)歸多為肝細(xì)胞凋亡、壞死，嚴(yán)重影響臨床預(yù)后，故其發(fā)病機(jī)制已成

2、為現(xiàn)今的研究熱點(diǎn)。主要相關(guān)的發(fā)病機(jī)制可大致概括為以下五點(diǎn)：1、鈣離子超載；2、氧自由基(ROS)生成過(guò)多；3、細(xì)胞因子；4、細(xì)胞凋亡、壞死；5、中性粒細(xì)胞等相關(guān)因素。目前認(rèn)為Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)信號(hào)通路在肝臟的發(fā)生發(fā)展、營(yíng)養(yǎng)代謝、肝細(xì)胞再生和腫瘤發(fā)生中均發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。β-catenin受損將導(dǎo)致肝臟對(duì)各種損傷刺激的敏感性增強(qiáng)，但其在肝臟缺血/再灌注損傷中的作用機(jī)制尚不明確。
　　 β-cat

3、enin是一個(gè)相對(duì)分子量為92000的細(xì)胞內(nèi)糖蛋白，基因在染色體的定位是3p21，正常情況下主要位于細(xì)胞膜，參與由上皮黏蛋白(E-Cad)介導(dǎo)的細(xì)胞黏附，但其在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中有著更為重要的作用。細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin與軸蛋白、糖原合酶激酶3b(GSK3b)、結(jié)腸腺瘤樣息肉(adenomatouspolyposiscoli，APC)蛋白、酪蛋白激酶1(caseinkinase1，CK1)構(gòu)成復(fù)合體，其中軸蛋白和APC蛋白作為支架蛋白

4、，而CK1和GSK3b對(duì)β-catenin蛋白進(jìn)行磷酸化，最終使β-catenin在蛋白酶體的作用下被降解。當(dāng)β-catenin失磷酸化時(shí)，會(huì)從復(fù)合體中脫落，向細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中積聚，與TCF/LEF結(jié)合，啟動(dòng)與細(xì)胞增殖或抗凋亡相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，這就是典型的Wnt/β-catenin信號(hào)通路；Wnt信號(hào)系統(tǒng)具有多效性，研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin軸在肝臟的發(fā)生發(fā)展、營(yíng)養(yǎng)代謝、肝細(xì)胞再生及腫瘤發(fā)生等方面均發(fā)揮著重要作用；盡管這些研究支持

5、β-catenin的生物學(xué)活性主要由與TCF/LEF相關(guān)的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)介導(dǎo)，近期有研究認(rèn)為β-catenin還可以發(fā)揮與TCF無(wú)關(guān)的轉(zhuǎn)錄輔激活物作用；在正常的生理?xiàng)l件下，β-catenin的生物學(xué)活性主要由與淋巴增強(qiáng)因子/T細(xì)胞因子(lymphoidenhancerfactororT-cellfactor，TCF/LEF)相關(guān)的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)，而在不利的病理?xiàng)l件下(缺氧或缺血/再灌注)，β-catenin則可能發(fā)揮與TCF無(wú)關(guān)的

6、轉(zhuǎn)錄輔激活物作用，幫助肝細(xì)胞適應(yīng)不良環(huán)境，增強(qiáng)生存能力。因此，研究β-catenin蛋白在肝臟缺血/再灌注中的作用及其調(diào)控機(jī)制，對(duì)于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)缺血/再灌注損傷的炎癥反應(yīng)機(jī)制，具有重要的科學(xué)意義。
　　 本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin小鼠，經(jīng)剪尾、DNA基因組抽提、PCR、明膠電泳鑒定等檢測(cè)，結(jié)果顯示，肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin小鼠構(gòu)建成功。經(jīng)過(guò)與Jackson實(shí)驗(yàn)室所提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比，我們成功構(gòu)建的肝細(xì)

7、胞特異性敲除β-catenin小鼠。通過(guò)將肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin小鼠建立部分肝臟缺血再灌注損傷模型，檢測(cè)β-catenin基因敲除組與對(duì)照組小鼠肝缺血再灌注損傷時(shí)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、相關(guān)炎性細(xì)胞因子及組織學(xué)改變等，探討β-catenin基因在肝臟缺血再灌注引起肝損傷中所起的作用。
　　 第一部分，β-cat缺陷小鼠的誘導(dǎo)構(gòu)建
　　 β-catenin是Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要成員之

8、一，參與體內(nèi)眾多病理生理過(guò)程的調(diào)節(jié)。近年來(lái)研究表明β-catenin在肝細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、應(yīng)激等過(guò)程中起到重要的作用。但β-catenin在肝臟缺血再灌注損傷中的作用研究極少，遂選取β-catenin作為本實(shí)驗(yàn)的研究基因，我們應(yīng)用Cre-lox系統(tǒng)構(gòu)建肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin基因小鼠模型。從JointVenturesSipperBK動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買(mǎi)的C57BL/6轉(zhuǎn)基因小鼠，4-6周齡，B6.Cg-Tg(MX1-cre)Cg

9、n/J小鼠與β-cateninloxP/LoxP(Ctnnblfl/fl小鼠，Jackson實(shí)驗(yàn)室)雜交，得到Mx-Cre×Ctnnblfl/fl小鼠(此處需剪尾抽提基因組DNA確認(rèn)是否為Mx-Cre×Ctnnb/fl/fl小鼠)，分別分3次給Ctnnblfl/fl小鼠和Mx-Cre×Ctnnblfl/fl小鼠腹腔內(nèi)注射poly(I：C)，2天注射1次，第6天給予最后一次注射，總和計(jì)量約250μg(12.5μg/kg)，然后將Mx-Cr

10、e×Ctnnblfl/fl小鼠再次剪尾抽提基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，明膠電泳鑒定，確認(rèn)已成功構(gòu)建β-catenin缺陷小鼠。
　　 第二部分，β-catenin對(duì)小鼠部分肝臟缺血再灌注損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：通過(guò)構(gòu)建特異性敲除小鼠模型觀察β-catenin基因在小鼠缺血再灌注損傷中的作用。方法：應(yīng)用Cre-lox系統(tǒng)構(gòu)建肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin基因小鼠模型，60min半肝血流阻斷制造肝臟缺血再灌注

11、小鼠模型，分別為β-catenin基因敲除組及對(duì)照組，再灌注后6h，剖殺小鼠，下腔靜脈取血，離心、取上清，測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)；切取肝左葉，10％福爾馬林固定。余肝組織液氮冰凍后保存于-80℃，隨后送至長(zhǎng)征醫(yī)院病理科行肝組織HE染色和免疫組織化學(xué)(IHC)檢測(cè)，觀察肝臟組織學(xué)改變；剩余肝組織行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)(RT-PCR)，觀察炎性因子的表達(dá)情況。結(jié)果：β-catenin基因敲除組的血清學(xué)指標(biāo)(ALT