FGFR3在小鼠小腸缺血再灌注損傷修復中的作用及機制研究.pdf

1、腸粘膜屏障損害導致細菌易位、腸源性感染，在多臟器功能衰竭中起重要作用。腸缺血再灌注損傷是腸粘膜屏障功能損害的常見原因。因此，加強腸粘膜的修復，預防或減輕腸屏障功能損害，對膿毒癥和MODS的防治具有非常重要的意義，但迄今這方面還沒有有效的治療方法。 缺血/再灌注(I/P)損傷后的腸屏障功能恢復與腸上皮細胞和腸血管內皮細胞的增殖、分化密切相關，而腸上皮細胞凋亡在腸缺血再灌注損傷中起重要作用。近年來發(fā)現的成纖維細胞因子是對腸上皮生長和

2、功能有重要調節(jié)作用的多肽，他們通過與其受體結合激活酪氨酸激酶活性，引起受體的自磷酸化隨后進入不同的信號傳遞途徑發(fā)揮作用，而成纖維細胞因子受體在胃腸道的生物學活性卻少有報道。有研究提示FGFR3參與放射損傷后的修復。而絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)是信號從細胞表面?zhèn)鞯郊毎藘炔康闹匾獋鬟f者。MAPK具有調節(jié)細胞生長、發(fā)育、分裂、死亡等多種細胞生理過程的作用，其亞類細胞外信號調節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)信號傳導通路是多種細胞外有絲分裂信號引

3、起細胞增殖的共同通路，與細胞增殖有密切關系。 本文擬觀察野生小鼠及FGFR3增強小鼠小腸發(fā)育階段的特點和FGFR3表達變化。另外采用小腸缺血再灌注模型，觀察野生小鼠及FGFR3增強小鼠小腸粘膜缺血再灌注損傷及再生修復的特征及規(guī)律，以及腸上皮細胞增殖、凋亡的情況，檢測I/R損傷后小腸FGFR3的基因表達與其對傷后腸上皮細胞ERKl/2活性的影響，從而確定FGFR3在介導腸上皮損傷修復中的作用，探討FGFR3促進I/R損傷后腸上皮細

4、胞修復的分子機制。最終為尋找促進腸上皮細胞損傷修復，防止腸屏障功能損害的新方法提供理論依據。 第一部分 FGFR3在小鼠小腸發(fā)育階段的作用 主要實驗內容及方法如下： 動物：Fgfr3369/+基因工程小鼠及C57BL/6J小鼠。 1.組織學方法觀察同窩增強突變小鼠與野生小鼠出生后第1、7、14、21、28、35天腸上皮發(fā)育過程中的組織形念學和掃描電鏡觀察超微結構變化。 2.腸上皮增殖能力檢測：用溴

5、脫氧尿苷(BrdUrd)標記7、14、21、28、35天兩組小鼠小腸上皮S期細胞(方法：按100ug/g(體重)劑量腹腔注射，2小時后取材)，免疫組化(SABC法)檢測其陽性表達情況。 3.免疫組化(SABC法)檢測兩組小鼠小腸組織FGFR3的表達情況。 4.提取1、7、14、21、28、35天兩組小鼠小腸組織RNA，通過RT-PCR擴增后進行凝膠電泳半定量檢測FGFR-3在各時相的表達水平。 主要實驗結果：

6、 1.突變小鼠絨毛分布密度及絨毛高度均差于同年齡野生小鼠，但隱窩深度卻是相反的。 2.增生的細胞主要位于腸隱窩部位，FGFR3增強突變小鼠在各時相點細胞增殖均強于野生小鼠。 3.小鼠出生后1天小腸即有FGFR3表達，7-21天表達較多，35天后表達減少。免疫組化檢測FGFR3表達位于腸隱窩部位，與Brdu表達信號部位相重疊。 第二部分 FGFR3在小鼠小腸缺血再灌注損傷修復中的作用及機制 主要實驗內容

7、及方法如下： 1.動物模型制備及分組：取6-8周齡小鼠，分為正常組、野生鼠I/R組和FGFR3增強小鼠I/R組，每組6只。術前12h禁食，自由飲水。用0.6％的戊巴比妥鈉(60mg/kg體重)腹腔注射麻醉，暴露腸系膜上動脈(SMA)，無創(chuàng)血管阻斷劑夾閉1h后松開形成再灌注。 2.標本采集、分離與儲存：正常組直接活殺，另兩組動物分別于松夾后1、3、6h和1、3d活殺?？綮o脈竇采血，使用肝素抗凝，充分混合，以3000rpm離

8、心10min后貯存于-20℃冰箱中，用以檢測血漿D-乳酸，使用美國Thermo LabsystemsMultiskan Spectrum全波長酶標儀(波長340 nm)檢測。選擇近端空腸，一部分腸管用4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，用以檢測小腸組織PCNA表達及凋亡情況；另一部分腸管立即放入-80℃冰箱凍存，用以檢測小腸組織FGFR3mRNA表達及MAPK活性檢測。 主要實驗結果： 1.腸缺血再灌注1、3、6h，腸粘膜

9、損害明顯，再灌注1d、3d組，腸粘膜結構恢復至正常。FGFR3增強小鼠在各時間點腸粘膜損害程度均輕于野生小鼠。 2.腸缺血再灌注1、3、6h，粘膜上皮細胞凋亡增加，再灌注1d、3d組腸粘膜上皮細胞凋亡明顯減少，FGFR3增強小鼠在各時間點凋亡程度均輕于野生小鼠。 3.腸缺血再灌注1、3、6h，粘膜隱窩上皮細胞增殖增多，再灌注Id、3d組粘膜隱窩上皮細胞增殖活性逐漸降低， FGFR3增強小鼠在各時間點增殖能力明顯強于野生小

10、鼠。 4.兩組小鼠缺血再灌注損傷后各時相點，血漿D-乳酸水平均明顯高于正常對照組小鼠，并且均在再灌注th后達到峰值，然后逐漸下降。但FGFR3增強小鼠在再灌注1、3、6h，D-乳酸水平均顯著低于野生小鼠。 5.兩組小鼠缺血再灌注損傷后FGFR3mRNA表達明顯增高，均在再灌注th后達到第一個峰值，然后迅速下降，于3h達到低谷，再迅速升高達到第二個峰值后逐漸下降，3d仍處于較高水平。 6.兩組小鼠的Erk在各時間點