自噬在肺缺血再灌注損傷中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景:肺缺血再灌注損傷是肺移植、袖式肺葉手術(shù)、心臟外科手術(shù)、心肺復(fù)蘇后綜合征等疾病中常見的引起不良后果的病理生理過程。以肺移植為例,有研究證實(shí),急慢性肺移植排斥反應(yīng)的發(fā)生均與肺移植術(shù)后早期肺缺血再灌注損傷的程度有關(guān)。已有的研究表明,肺缺血再灌注損傷主要表現(xiàn)為肺間質(zhì)水腫、炎癥細(xì)胞浸潤、呼吸膜斷裂和氣體交換障礙。然而,肺缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的整體機(jī)制仍未被全面了解。
　　自噬是真核生物進(jìn)化高度保守的細(xì)胞自穩(wěn)程序。一方面,雙膜結(jié)構(gòu)的自

2、噬囊泡能包繞隔絕失功能的細(xì)胞器、結(jié)構(gòu)破壞的蛋白質(zhì)和侵入細(xì)胞的病原體等。另一方面,自噬體與溶酶體結(jié)合消化囊內(nèi)物進(jìn)而為細(xì)胞代謝提供底物。生理狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)一定水平的自噬對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起重要作用。當(dāng)被過度誘導(dǎo)時,自噬也能導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡,與凋亡不同,這一過程被稱之為II型程序性死亡。另外,由于自噬與凋亡的復(fù)雜聯(lián)系,一定程度的自噬甚至直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此,細(xì)胞自噬被認(rèn)為是細(xì)胞在壓力條件下的適應(yīng)機(jī)制。
　　國內(nèi)外越來越多的研究發(fā)現(xiàn)

3、自噬在許多病理生理學(xué)狀態(tài)中扮演重要作用,例如腫瘤、感染、神經(jīng)退行性疾病等。國外有研究證實(shí)缺血再灌注過程能夠誘導(dǎo)自噬水平的快速上調(diào)。ChigureSuzuki等人的研究認(rèn)為自噬參與了腎臟的缺血再灌注損傷。然而,ManJiang等在另一個腎臟缺血再灌注損傷模型中發(fā)現(xiàn)自噬在腎臟缺血再灌注損傷中是一種腎臟保護(hù)因素。在肝臟中,KunihitoGotoh等發(fā)現(xiàn)藥物抑制自噬能夠改善肝移植術(shù)后的肝臟缺血再灌注損傷程度。因此,有學(xué)者推測自噬在缺血再灌注損

4、傷中的作用可能是組織和模型依耐性的。當(dāng)前,自噬較少涉及呼吸系統(tǒng)疾病的研究,僅在吸煙、COPD、肺動脈高壓等慢性呼吸系統(tǒng)疾病的肺組織中發(fā)現(xiàn)自噬水平升高,高水平的自噬與細(xì)胞的凋亡,組織纖維化與重構(gòu)密切相關(guān)。許多學(xué)者預(yù)測:自噬將成為肺部疾病基礎(chǔ)研究中一個新的前沿領(lǐng)域。那么,肺缺血再灌注時肺內(nèi)細(xì)胞自噬水平如何?自噬在肺缺血再灌注損傷中作用如何?本研究試圖在大鼠左肺原位熱缺血再灌注損傷模型中尋找答案。
　　目的:建立大鼠左肺原位熱缺血再灌注

5、損傷模型,觀測大鼠肺缺血再灌注后肺組織內(nèi)細(xì)胞自噬水平的變化,探討肺缺血及再灌注對細(xì)胞自噬流的影響。藥物干預(yù)自噬,研究自噬在肺缺血再灌注損傷中的作用,并初步探索自噬在肺缺血再灌注損傷中發(fā)揮作用的可能機(jī)制。
　　方法:以SPF級SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動物,建立左肺原位熱缺血再灌注損傷模型。運(yùn)用免疫印跡法檢測缺血1h和再灌注0、2、6、24h后肺組織內(nèi)自噬標(biāo)志蛋白LC3表達(dá)水平,免疫熒光染色法雙標(biāo)自噬體標(biāo)志蛋白LC3與溶酶體膜蛋白LAMP2,

6、鑒定自噬體與溶酶體融合降解是否正常,電子顯微鏡觀測細(xì)胞內(nèi)自噬體,分析大鼠左肺缺血再灌注后肺組織內(nèi)細(xì)胞自噬水平變化情況。比較缺血3h、缺血1h再灌注2h、陽性對照組、假手術(shù)組自噬水平,分析缺血和再灌注對自噬的誘導(dǎo)作用。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)和安慰劑分別預(yù)處理大鼠,檢測左肺缺血1h再灌注2h后肺干濕重比(LungW/DRatio),MDA(malondialdehyde)濃度,MPO(myeloperoxidase)活性等肺損

7、傷指標(biāo),HE染色評價肺組織病理學(xué)損傷程度,并驗(yàn)證3-MA抑制細(xì)胞自噬能力,分析自噬在肺缺血再灌注損傷中的作用。免疫印跡法檢測3-MA處理組和對照組肺組織中凋亡關(guān)鍵蛋白cleavedcaspas-3表達(dá)水平,TUNEL(terminaldUTPnickend-labelingassay)法檢測肺組織中凋亡細(xì)胞比率,分析自噬參與肺缺血再灌注損傷的可能機(jī)制。
　　結(jié)果:在大鼠左肺熱缺血再灌注損傷模型中,自噬水平在缺血1h即有升高(P<0

8、.05),再灌注2-6h達(dá)到高峰(P<0.01),再灌組24h恢復(fù)至接近假手術(shù)組水平(P>0.05),電子顯微鏡檢查主要在I型肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)觀察到自噬體。缺血1h再灌注2h較缺血3h自噬水平高,與雷帕霉素處理的陽性對照組自噬水平相當(dāng)。30mg/kg3-MA預(yù)處理與對照組比較降低肺組織損傷評分(P<0.05),降低肺W/D,降低肺組織中MDA濃度和MPO活性。WesternBlot結(jié)果示30mg/kg3-MA能有效抑制細(xì)胞自