丁苯酞對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷自噬的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：通過丁苯酞、SP600125（JNK的特異性抑制劑）對(duì)缺血再灌注大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，借助Western blot、HE染色、TUNEL、透射電鏡等實(shí)驗(yàn)方法，探討丁苯酞對(duì)缺血再灌注損傷后自噬的影響及其與自噬相關(guān)蛋白Beclin-1，LC3-Ⅱ的變化；JNK3信號(hào)通路是否參與缺血再灌注損傷中自噬的調(diào)控；丁苯酞對(duì)自噬的影響是否通過JNK3信號(hào)通路來調(diào)控的。
　　方法：將100只（250-300）g健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為五組：假手術(shù)

2、組、模型組、丁苯酞干預(yù)組、SP600125組、丁苯酞+SP600125組。每組20只大鼠。丁苯酞組及丁苯酞+SP600125組于造模前一星期開始每天給予8 mg·mL-1的NBP溶液1 mL·100 g-1灌胃；假手術(shù)組、SP600125組、模型組給予單純麻油1 mL·100 g-1。同時(shí)SP600125組及丁苯酞+SP600125組予以SP600125與40％PEG400配成1mg·mL-1溶液1 mL·100 g-1腹腔注射給藥。假

3、手術(shù)組、模型組、丁苯酞組予以同等劑量（40%PEG400）1 mL·100 g-1腹腔注射。Longa線栓法制作大鼠MCAO模型缺血2小時(shí)再灌注12小時(shí)。使用Longa評(píng)分法評(píng)價(jià)神經(jīng)功能缺損；分別采用TTC染色判斷缺血再灌注模型是否成功；HE染色檢測(cè)腦組織病理變化；血清NSE含量評(píng)估腦缺血再灌注損傷后腦功能的損害；原位末端脫氧核昔酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)缺血再灌注損傷后CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡與壞死；通過透射電鏡觀察缺血再灌注損傷后

4、CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)自噬體形態(tài)、數(shù)量；WesternBlot檢測(cè)大鼠CA1區(qū)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1，LC3-Ⅱ的表達(dá)和JNK3信號(hào)通路相關(guān)蛋白JNK3，p-JNK的表達(dá)。
　　結(jié)果：1.Longa評(píng)分：(1)首次評(píng)分:假手術(shù)組未見神經(jīng)功能缺損癥狀。模型組（2.00±0.82）較假手術(shù)組（0）明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；NBP治療組（1.83±0.50）、SP600125組（1.88±0.52）及NBP+SP60

5、0125組（1.85±0.41）三組兩兩比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05），但分別與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。(2)缺血再灌注12小時(shí)后評(píng)分：模型組（2.65±0.50）分別與首次評(píng)分及假手術(shù)組（0）比較均明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；NBP治療組（1.53±0.52）、SP600125組（1.55±0.43）及NBP+SP600125組（1.58±0.55）三組兩兩比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0

6、.05）,但較模型組及首次評(píng)分均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　2.TTC染色：假手術(shù)組腦組織染色為鮮紅色，模型組、丁苯酞組、丁苯酞+SP600125組、SP600125組均可見皮層及皮層下有明顯的白色梗死灶，各組相對(duì)梗死灶體積分別為：模型組（25.56±1.86）較假手術(shù)組（0）比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）；丁苯酞組（18.26±2.23）,丁苯肽+SP600125組（17.86±2.12)，SP60

7、0125組（17.98±2.52）三組間兩兩比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）,但分別與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　3.HE染色：各組海馬 CAl區(qū)變化：假手術(shù)組，神經(jīng)元排列整齊，形態(tài)圓形較規(guī)整，數(shù)量正常，胞漿均勻紅染，核大而圓呈淡藍(lán)色，核膜邊界清晰；模型組，神經(jīng)元排列紊亂，數(shù)量顯著降低，胞漿皺縮空泡形成，胞核固縮呈藍(lán)紫色；丁苯酞組、丁苯酞+SP600125組、SP600125組三者兩兩比較無明顯差異，

8、可見大量神經(jīng)元存活，邊界尚清，形態(tài)較規(guī)整，胞核形狀較規(guī)則邊界清晰，少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)核染色加深，胞漿部分消失等變性表現(xiàn)。
　　4.TUNEL染色:各組海馬 CAl區(qū)神經(jīng)元凋亡表達(dá)量為：模型組（0.52±0.05）分別與假手術(shù)組（0.05±0.02）、丁苯酞組（0.31±0.03）、SP600125組（0.30±0.02）以及丁苯酞+SP600125組（0.32±0.04）明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。丁苯酞組（0.31±0

9、.03）、SP600125組（0.30±0.02）以及丁苯酞+SP600125組（0.32±0.04），三組之間兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
　　5.NSE-ELISA測(cè)定：假手術(shù)組(1.89±0.13)、丁苯酞組(5.10±0.15)、SP600125組(5.21±0.11)以及丁苯酞+SP600125組(5.05±0.15)分別與模型組(9.83±0.21)比較，結(jié)果表明血清NSE含量均低于模型,差異有顯著統(tǒng)計(jì)

10、學(xué)意義（p<0.01)。而丁苯酞組、SP600125組以及丁苯+SP600125組三者之間兩兩比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
　　6.westem blot:實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：p-JNK、JNK、Beclin-1、LC3-Ⅱ水平模型組比丁苯酞組、SP600125組、丁苯酞+SP600125組、假手術(shù)組(A組)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。而丁苯酞組、SP600125組、丁苯酞+SP600125組三者之間兩兩比較,差異

11、無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
　　7.透射電鏡：各組CA1區(qū)電鏡：假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，線粒體無腫脹，未見自噬體；模型組可見泡狀的自噬溶酶體,神經(jīng)元細(xì)胞核染色質(zhì)固縮；丁苯酞組、SP600125組、SP600125+丁苯酞組可見雙層膜結(jié)構(gòu)形成，包繞細(xì)胞器形成自噬體，少量圓形溶酶體，大多位于細(xì)胞核旁,同時(shí)可見初級(jí)溶酶體、次級(jí)溶酶體數(shù)量增多以及線粒體腫脹。
　　結(jié)論:1.大鼠腦缺血再灌注損傷后可誘發(fā)自噬的過度激活；