落新婦苷對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷及自噬的影響.pdf

1、目的:
　　1、探索大鼠正常肝臟和缺血再灌注損后肝臟中的細(xì)胞自噬現(xiàn)象。
　　2、探討落新婦苷對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷（HIRI）預(yù)處理的作用機(jī)制，觀察保護(hù)效應(yīng)與自噬水平的變化，為肝臟缺血再灌注損傷的治療提供一定的依據(jù)。
　　方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)分組:54只健康SD大鼠（均為雄性，體重大約250～300g）隨機(jī)分為3組，分別為落新婦苷預(yù)處理組、HIRI組（缺血再灌注組）以及Sham組（假手術(shù)組），每組18只;再按術(shù)

2、后4h、8h、16h三個(gè)時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段各6只。
　　2、建立模型:各組大鼠術(shù)前12h禁食、不禁水，落新婦苷預(yù)處理組，術(shù)前7天開(kāi)始每日上午08:00給予落新婦苷腹腔按照劑量為每千克大鼠40毫克注射，HIRI組和Sham組給予同樣劑量生理鹽水每日上午08:00腹腔注射。落新婦苷預(yù)處理組和HIRI組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后，行腹部正中切口，逐層切開(kāi)，打開(kāi)腹膜進(jìn)入腹腔，暴露肝臟，找到第一肝門;游離支配肝左、中葉的脈

3、管，并用無(wú)創(chuàng)血管夾夾閉脈管的共干，觀察肝臟顏色的變化，肝左、中葉的顏色變深，即已建立約70％的肝臟缺血模型;夾閉時(shí)間大約45分鐘，重新恢復(fù)血流，逐層縫合切口。Sham組僅行上腹部正中切口，逐層進(jìn)入腹腔后輕輕游離肝門，無(wú)需夾閉脈管，直接縫合關(guān)腹。
　　3、樣本的采集和觀察指標(biāo)的測(cè)定:分別于手術(shù)后4h、8h、16h取抽取下腔靜脈血及大鼠肝左外葉作為標(biāo)本，檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，光學(xué)顯微鏡下觀察Sham組、H

4、IRI組及落新婦苷組不同時(shí)間段的肝細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)變化;Western Blot分析肝組織中LC3、Beclin-1的表達(dá);電鏡下觀察肝臟組織內(nèi)自噬小體數(shù)量情況。
　　結(jié)果:
　　1、54只健康SD大鼠手術(shù)后都能在一定時(shí)間內(nèi)復(fù)蘇，維持有效的呼吸與心跳，并且能相應(yīng)活動(dòng)。
　　2、術(shù)后肝功能主要是檢測(cè)血清ALT和AST水平的變化，HIRI組的ALT和AST水平較假手術(shù)組明顯升高，而落新婦苷組與HIRI組相比明顯降低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)

5、意義(P＜0.05)。
　　3、術(shù)后肝組織HE染色顯示Sham組肝小葉、肝匯管區(qū)結(jié)構(gòu)顯示清晰，肝細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。術(shù)后4h時(shí)，HIRI組中肝細(xì)胞索排列出現(xiàn)紊亂，部分肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，并有炎性細(xì)胞浸潤(rùn);落新婦苷組中只見(jiàn)少許肝細(xì)胞水腫。術(shù)后8h HIRI組，肝細(xì)胞索排列嚴(yán)重紊亂，肝匯管區(qū)結(jié)構(gòu)顯示模糊，出現(xiàn)肝細(xì)胞的大片壞死;落新婦苷組肝細(xì)胞只見(jiàn)輕度水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝匯管區(qū)結(jié)構(gòu)顯示清晰。術(shù)后16h HIRI組中肝細(xì)胞損傷

6、減輕，細(xì)胞形態(tài)較前有改善;落新婦苷組中肝細(xì)胞的形態(tài)基本正常。
　　4、通過(guò)Western blotting檢測(cè)術(shù)后肝組織中LC3、Beclin-1蛋白的表達(dá)，與相Sham組比較，HIRI組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ灰度值比值及Beclin-1灰度值在術(shù)后各個(gè)時(shí)段均明顯升高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在8h時(shí)達(dá)到高峰，在16h時(shí)下降。落新婦苷組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1灰度值比值在術(shù)后各個(gè)時(shí)段均較HIRI組下降，且

7、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);結(jié)果提示落新婦苷在術(shù)后各個(gè)時(shí)段均可以減輕LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值和Beclin-1蛋白的表達(dá)。
　　5、電鏡下觀察再灌注8小時(shí)三組大鼠肝臟的自噬小體的數(shù)量，結(jié)果顯示，與Sham組(0.69±0.04)大鼠肝臟的平均自噬小體數(shù)量相比，HIRI組（7.12±0.60）大鼠肝臟的平均自噬小體數(shù)量有所增多，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與HIRI組大鼠肝臟的平均自噬小體數(shù)量相比，落新婦苷組（3.68±

8、0.42）大鼠肝臟的平均自噬小體數(shù)量有所下降，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)落新婦苷預(yù)處理后，大鼠肝臟缺血再灌注損傷后血清轉(zhuǎn)氨酶水平明顯下降，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)落新婦苷組較HIRI組肝細(xì)胞形態(tài)及炎癥浸潤(rùn)情況等明顯減輕。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ灰度值比值以及Beclin-1灰度值在術(shù)后各個(gè)時(shí)段均較HIRI組下降，提示落新婦苷可減輕術(shù)后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值和Beclin-1蛋白的表達(dá)，表明落

9、新婦苷預(yù)處理可降低大鼠HIRI后的自噬水平。電鏡下的結(jié)果顯示正常大鼠術(shù)后也存在少量自噬小體，HIRI組自噬小體最多，而落新婦苷組肝臟細(xì)胞的自噬小體數(shù)量比HIRI組有所減少，這也證實(shí)了落新婦苷預(yù)處理確實(shí)降低了大鼠HIRI后的自噬水平。
　　綜上所述，正常大鼠肝臟也存在自噬現(xiàn)象，落新婦苷預(yù)處理可減輕大鼠HIRI，其怍用機(jī)制可能與下調(diào)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值及Beclin-1蛋白的水平，從而抑制自噬有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)從自噬的角度來(lái)分析落