長期的標志保留細胞在小鼠缺血再灌注腎臟損傷修復過程中的作用.pdf

1、目的：
　　1.觀察成年小鼠腎臟缺血再灌注損傷后是否具有一定的組織自身修復能力;
　　2.明確成年小鼠腎臟是否存在其新生時標記的LRCs及其分布位置和特征;
　　3.探討腎臟固有的長期標記的LRCs是否參與急性腎臟損傷后腎臟自身修復過程及其作用;明確其是否可以被認為是真正的成體腎臟干細胞或祖細胞壁龕。
　　方法：
　　1.長期BrdU標記小鼠的模型構建。為標記長期的腎臟固有LRCs，本文在出生后12小時的新

2、生C57BL/6J小鼠腹腔內注射BrdU（50μg/g），每天2次，連續(xù)注射3天。此后，這些新生小鼠在沒有任何醫(yī)療操作的情況下生長至8周齡。
　　2.成年小鼠腎臟缺血再灌注的模型構建。文章選取在新生已標記BrdU的8周齡雄性C57BL/6J小鼠，并隨機分為以下各組:假手術組(n=30)，腎臟缺血再灌注組(n=40)。實驗處理如下:小鼠使用水合氯醛麻醉后，打開動物腹腔，使用無創(chuàng)性的微血管夾夾閉雙側腎血管22分鐘，然后去除微血管夾，觀

3、察腎臟再灌注情況，關腹后注射預溫37℃生理鹽水1ml以補充手術過程中體液的丟失。假手術組動物行開腹手術后，游離雙側腎蒂組織，但不進行腎血管夾閉，隨后關腹。整個手術操作過程中，小鼠身體保持在一個37℃恒溫電熱毯上。分別于手術后1d、2d、3d、4d、5d、6d、9d、14d、28d處死小鼠，采集血液及心肝腎臟組織。
　　3.腎臟功能評估。處死小鼠前留取血液標本，利用臨床生化室儀器檢測血清中尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)。
　　

4、4.腎臟病理檢測。腎臟組織采用常規(guī)HE染色，通過顯微鏡觀察小鼠腎臟缺血再灌注術后成體腎臟損傷修復的組織形態(tài)學變化。腎臟組織采用免疫組織化學染色來計數(shù)定位LRCs。除利用常規(guī)的免疫組織化學染色技術定位成體小鼠腎臟BrdU標記的LRCs外，為了更準確清晰的計數(shù)BrdU標記，實驗中部分免疫組織化學染色標本未進行常規(guī)的蘇木素細胞核染色。每張病理標本在200倍顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)視野中BrdU陽性細胞核數(shù)，取其平均值計量為BrdU陽性細

5、胞數(shù)量。
　　5.雙色免疫熒光檢測。采用腎臟組織冰凍切片進行免疫熒光檢測，使用熒光顯微鏡觀察并攝影羅丹明、FITC標記的熒光二抗，從而間接檢測腎臟組織中BrdU及Ki-67、BrdU及TUNEL、BrdU及LAT的表達。DAPI用于標記腎臟組織細胞核位置。
　　6.統(tǒng)計學處理。服從正態(tài)分布的實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差((x)±s)的方式表示，使用統(tǒng)計軟件SPSS16.0處理，采用單因素方差分析進行組間均數(shù)的比較，P＜0.05被

6、認為具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.成年小鼠腎臟缺血再灌注損傷后腎組織恢復情況
　　1.1腎臟功能恢復情況
　　與假手術組相比，腎臟缺血再灌注組小鼠Scr、BUN在術后1天內顯著升高，于術后24小時達到高峰。與術后基線相比，Scr值在術后24小時末約升高9倍(24小時末Scr vs術后基線Scr:175.93±36.61 umol/l vs19.53±5.03 umol/l，p＜0.05)，此后Scr值逐漸

7、降低，到術后第9天恢復正常水平。BUN值變化趨勢基本與Scr值一致。
　　1.2腎臟組織形態(tài)學恢復情況
　　為了更直觀的反應腎臟缺血再灌注損傷后組織修復再生情況，我們進行了腎臟病理HE染色。病理切片顯示術后24小時小鼠腎臟組織可以觀察到典型的腎小管損傷，這些典型的損傷在術后第3天仍然可以觀察到，分布在腎臟組織的皮質、髓質，甚至腎乳頭部。但是，在術后第4天，病理切片上可以明顯地觀察到新生小管細胞大量增殖，這些新生的聚集細胞趨向

8、于形成一種特殊的類似于細胞壁龕樣(the special niches-like structure)的結構。在接來下的3～5天內，腎臟組織結構快速恢復，腎小管擴張、小管上皮細胞崩潰脫落、管腔內刷狀緣消失、管腔基底膜裸露等典型腎小管損傷明顯減少。術后第9天，腎臟皮髓質及乳頭部結構開始趨向正常。
　　2.成年小鼠腎臟長期標記的LRCs分布
　　2.1成年小鼠長期標記的LRCs分布位置及形態(tài)
　　新生小鼠體內標記BrdU8

9、周后，成年小鼠腎臟內可以觀察到零散分布的BrdU+ LRCs。大多數(shù)的LRCs分布在腎小管細胞，少量的LRCs分布在腎組織間質，其中有一部分LRCs是成對出現(xiàn)的;這些成對出現(xiàn)的LRCs約占其總量的21.7±1.5％。另外，我們觀察到在成年小鼠腎臟內長期標記的BrdU+LRCs的細胞核形態(tài)學特征并不一致，其中一些表現(xiàn)出核碎裂和核溶解現(xiàn)象，約占LRCs總量的10.1±0.9％。
　　2.2成鼠腎臟缺血再灌注損傷后長期標記的LRCs分布

10、位置及計數(shù)
　　與假手術組比較，被標記有BrdU的雄性8周齡腎臟缺血再灌注組的小鼠腎組織內BrdU+LRCs的數(shù)量隨腎功能恢復而逐漸減少。其中術后第4天LRCs的數(shù)量減少最為顯著，在腎皮質、髓質及腎乳頭部分別減少85±2％，81±5％及95±5％。在術后第28天，腎組織內BrdU+LRCs很難被檢測到。
　　3.長期標記的LRCs中只有部分細胞積極參與到成鼠腎臟缺血再灌注損傷修復過程中
　　術后第4天，腎臟缺血再灌注小

11、鼠的腎組織內可見大量腎小管細胞增殖，同時損傷壞死的腎小管明顯減少。在這個損傷修復階段，本文用Ki-67抗體標記新增殖的細胞、用TUNEL抗體標記凋亡壞死細胞。腎臟病理冰凍切片免疫熒光顯示Ki-67標記的新增殖的細胞形成一種類似于壁龕樣的特殊結構，這一結果與腎臟病理HE染色觀察結果一致。但是，并不是所有的BrdU+ LRCs都位于這個結構內，只有那些成對出現(xiàn)的LRCs才趨向于與Ki-67共表達。另外，免疫熒光結果顯示部分零散分布的LRCs

12、趨向于與TUNEL共表達。
　　4.成鼠腎臟缺血再灌注損傷修復過程中長期標記的LRCs生物學特點
　　為了進一步明確成鼠腎臟LRCs的分化特征，本文選取了近端腎小管分化成熟標記物LTA，以研究LRCs分化程度，并判斷其是否真正具有腎臟干細胞或祖細胞性質。雙色免疫熒光結果顯示損傷早期及正常成鼠腎組織可觀察到一些零散分布的BrdU+LRCs與成熟的近端小管標志物LTA共表達，然而有趣的是，那些成對分布的BrdU+LRCs并未與L

13、TA共表達。
　　結論：
　　1.本研究通過小鼠缺血再灌注模型證實成鼠急性腎損傷后具有自身修復再生能力，并發(fā)現(xiàn)損傷后大量新生的腎小管細胞趨向于聚集形成一種類似于壁龕樣的結構以促進受損腎組織結構恢復。
　　2.本研究結果證實成年小鼠腎臟存在零散分布的少量長期標記的LRCs，其中只有部分LRCs積極參與到成年小鼠腎臟急性損傷修復過程中。這部分LRCs主要表現(xiàn)為在損傷后新增生的細胞中成對出現(xiàn)。
　　3.本研究首次發(fā)現(xiàn)長

14、期標記的LRCs細胞核形態(tài)呈現(xiàn)多樣性，有的甚至表現(xiàn)出核碎裂和核溶解。在小鼠腎臟急性腎損傷修復的同一階段其細胞表型也不一致。因此，文章認為成鼠腎臟中長期標記的LRCs不是單純的一種細胞;并提示在應用其尋找定位腎臟固干細胞的研究中，其生物學特性的復雜性應該被充分重視。
　　4.本研究顯示在小鼠腎臟缺血再灌注損傷后，早期修復出現(xiàn)前，長期標記的LRCs有的已呈現(xiàn)終末分化狀態(tài)，進一步證實并不是腎臟全部的LRCs都可以被認為是慢周期細胞來定位