Intermedin對(duì)腎臟缺血再灌注損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、垂體中葉素Intermedin(IMD)是新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性心血管、腎臟保護(hù)因子，屬降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)超家族成員，對(duì)其在腎臟的保護(hù)機(jī)制尚不清楚。本研究采用分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)手段，對(duì)IMD在腎臟缺血再灌注損傷(IRI)中的病理生理意義及其機(jī)制進(jìn)行探討。分為以下兩個(gè)部分： 一、大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型中IMD及其受體的變化。 目的：制備大鼠腎臟IRI

2、模型，觀察IMD及其受體系統(tǒng)的變化，初步探討IMD在腎臟IRI中的作用。 方法：健康雄性Wistar大鼠18只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血組和IRI組。雙側(cè)夾閉腎動(dòng)脈45min，再灌注12h制作IRI模型。檢測血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)濃度，并半定量分析腎臟病理組織學(xué)變化判斷模型成功與否。放射免疫分析法測定血漿、腎組織IMD及血漿腎上腺髓質(zhì)素(ADM)含量。半定量反轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測腎組織IMD、AD

3、M及其受體系統(tǒng)CRLR、RAMP1、2、3mRNA表達(dá)；Western blotting方法半定量分析腎組織IMD及其受體CRLR的蛋白表達(dá)。 結(jié)果： (1)與假手術(shù)組相比，IRI組大鼠BUN和SCr明顯升高(P＜0.05)；病理組織學(xué)顯示IRI組大鼠腎小管上皮細(xì)胞空泡狀變性、刷狀緣壞死脫落等，而腎小球無明顯改變，半定量評(píng)分顯示該組與假手術(shù)組和缺血組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(分別為P＜0.05，P＜0.01)，符合急性腎損傷病

4、理改變，造模成功。 (2)大鼠血漿、腎組織IMD含量，IRI組較假手術(shù)組升高53.76％、40.01％(P＜0.05)；較缺血組升高58.34％、42.97％(P＜0.05)；血漿ADM含量，IRI組較假手術(shù)組升高143.22％(P＜0.01)，較缺血組升高101.96％(P＜0.01)。 (3)與假手術(shù)組相比，IRI組腎組織IMD、ADM、CRLR、RAMP1、RAMP2、RAMP3 mRNA相對(duì)含量分別上調(diào)了22.1

5、％(P＜0.05)、41.1％(P＜0.01)、32.8％(P＜0.01)、33.7％(P＜0.01)、35.9％(P＜0.05)、29.4％(P＜0.01)；IMD和CRLR蛋白表達(dá)明顯增高，分別增加了80.9％，68.4％(P＜0.001)。 結(jié)論：腎臟IRI模型中血漿和腎組織IMD水平顯著增加，同時(shí)腎組織IMD及受體系統(tǒng)CRLR/RAMPs的mRNA表達(dá)和腎組織IMD、CRLR的蛋白表達(dá)均出現(xiàn)與血漿和腎組織IMD水平變化趨

6、勢一致的增加，提示IMD參與了腎臟IRI的病理生理過程，可能在保護(hù)腎臟方面有重要意義。 二、IMD對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型的影響及機(jī)制研究。 目的：以腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)缺氧復(fù)氧(H/R)模型模擬在體IRI，通過轉(zhuǎn)染IMD真核表達(dá)質(zhì)粒，探討IMD細(xì)胞保護(hù)的分子機(jī)制。 方法： (1)利用三氣培養(yǎng)箱調(diào)整氮?dú)鈮毫π纬扇毖鯒l件，在缺氧1h，復(fù)氧1.5h后檢測NRK-52E活細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞存活率

7、和培養(yǎng)液上清乳酸脫氫酶(LDH)含量判斷H/R模型成功與否。 (2)人工合成IMD目的片段，與pMD19—TSimple載體連接形成克隆載體，再通過雙酶切定向克隆技術(shù)將其亞克隆至pIRES2-EGFP，構(gòu)建IMD真核表達(dá)載體，命名為pIRES2-EGFP/IMD，測序鑒定。 (3)利用Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑，將pIRES2-EGFP/IMD表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至NRK-52E細(xì)胞內(nèi)，以倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率，

8、選定最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件：并以RT-PCR和Western blotting方法觀察其對(duì)細(xì)胞IMDmRNA和蛋白表達(dá)的影響；以G418300μg/ml加入10％胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選約2周，獲得穩(wěn)定表達(dá)IMD的陽性克隆NRK-52E，Western blotting鑒定篩選后IMD蛋白的表達(dá)。 (4)對(duì)NRK-52E進(jìn)行H/R實(shí)驗(yàn)，分為對(duì)照組和6個(gè)模型組包括單純H/R組、空質(zhì)粒組、IMD質(zhì)粒組、IMD+PKA

9、抑制劑(H-89)組、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)類似物(8—Br—cAMP)組和NADPH氧化酶抑制劑(DPI)組，分別檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH、cAMP含量，細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)水平，觀察IMD對(duì)H/R時(shí)氧化損傷的影響及分子機(jī)制。 結(jié)果： (1)經(jīng)缺氧1h，復(fù)氧1.5h后，NRK-52E細(xì)胞計(jì)數(shù)量降低，存活率下降，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH含量顯著增加(P＜0.05)，造模成功。

10、 (2)酶切和測序鑒定表明，pMD19—TSimple/IMD克隆質(zhì)粒和pIRES2-EGFP/IMD真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。 (3)熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示以質(zhì)粒3μg：FuGENE HD12μl配比的轉(zhuǎn)染復(fù)合體在48h的轉(zhuǎn)染效率最高，轉(zhuǎn)染效率最高可達(dá)71.34±6.24％(P＜0.01)；半定量RT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)重組質(zhì)粒組IMD mRNA表達(dá)量較未轉(zhuǎn)染組增高(P＜0.01

11、)，蛋白表達(dá)也顯著增高(P＜0.001)。G418篩選后轉(zhuǎn)染陽性的細(xì)胞于第3天起逐漸出現(xiàn)克隆樣增殖，第5天起未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞出現(xiàn)批量死亡，以后陽性細(xì)胞克隆逐漸增加，至第14天可見融合成片狀的陽性克隆細(xì)胞，約占總細(xì)胞的60～70％。Western blotting結(jié)果顯示，篩選后IMD蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)高表達(dá)，說明細(xì)胞得到穩(wěn)定表達(dá)。 (4)給予各種干預(yù)因素后，各檢測指標(biāo)的變化如下： ①LHD含量：與對(duì)照組相比，各模型組LDH顯著上

12、升(P＜0.01)；與H/R組相比，IMD質(zhì)粒組與8—Br—cAMP組LDH上升幅度較小(P＜0.05)。 ②cAMP含量：與對(duì)照組相比，各模型組cAMP含量明顯增加，其中IMD質(zhì)粒+H-89組和8—Br—cAMP組升高最為顯著(P＜0.01)；與H/R組相比，IMD質(zhì)粒+H-89組和8—Br—cAMP組的cAMP含量上升幅度最顯著(P＜0.01)，IMD質(zhì)粒組也有所上升，DPI組卻有所下降(P＜0.05)。 ③NADP

13、H氧化酶含量：除DPI組外各模型組NADPH氧化酶含量均明顯升高(P＜0.01)，其中8—Br—cAMP組升高幅度最小(P＜0.05)；與H/R組比較，8—Br—cAMP組和DPI組的NADPH氧化酶含量分別下降了33.92％(P＜0.05)、52.54％(P＜0.01)。 ④MDA含量：與對(duì)照組相比，模型組中H/R組(P＜0.01)、空質(zhì)粒組(P＜0.01)、IMD質(zhì)粒+H-89組(P＜0.05)和DPI組(P＜0.05)的M

14、DA含量增加；與H/R組比較，IMD質(zhì)粒組、IMD質(zhì)粒+H-89組、8—Br—cAMP組和DPI組的MDA均有所下降(P＜0.05)。 ⑤ROS含量：與對(duì)照組相比，模型組中H/R組、空質(zhì)粒組、IMD質(zhì)粒+H-89組的ROS含量增加(P＜0.05)；與H/R組比較，IMD質(zhì)粒組的ROS含量有所下降(P＜0.05)。 ⑥SOD含量：模型組中IMD質(zhì)粒組、IMD質(zhì)粒+H-89組和DPI組的SOD含量有所升高(P＜0.05)，其