TLR信號(hào)在腸道缺血再灌注損傷中的作用.pdf

1、研究背景:
　　缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury,IRI)是指在缺血的基礎(chǔ)上,血供恢復(fù)后，組織的缺血性損傷和功能障礙不但沒(méi)有減輕，反而在原來(lái)的基礎(chǔ)上加重的現(xiàn)象，嚴(yán)重的感染，創(chuàng)傷和休克等均可以引起IRI。缺血再灌注損傷的防治直接關(guān)系到相關(guān)疾病的轉(zhuǎn)歸及預(yù)后。腸道是缺血反應(yīng)敏感的組織之一，腸道缺血再灌注不僅可引起腸粘膜組織的局部損傷，甚至引發(fā)腸道菌群移位及內(nèi)毒素血癥，損害遠(yuǎn)處器官，被認(rèn)為是全身炎癥反

2、應(yīng)綜合征（SIRS）和多器官功能障礙綜合征（MODS）的發(fā)動(dòng)機(jī)【1-2】.腸道缺血再灌注損傷是嚴(yán)重創(chuàng)傷，感染，失血性休克，壞死性胰腺炎，絞窄性腸梗阻等急重癥發(fā)病后常見的病理生理過(guò)程，可引起腸粘膜屏障的破壞。腸粘膜屏障破壞意味著腸內(nèi)細(xì)菌和菌素移位，釋放腸源性介質(zhì)和預(yù)激循環(huán)白細(xì)胞，并觸發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征甚至多器官功能衰竭【3,4】。疾病一旦發(fā)展至MODS期，臨床治療效果極差，死亡率也極高.目前認(rèn)為SIRS是MODS的前驅(qū)表現(xiàn)，但SIRS的

3、發(fā)病機(jī)理尚不完全清楚，立足于全身炎癥反應(yīng)的角度，認(rèn)為腸道在SIRS和MODS的發(fā)病中不僅僅是被損傷的靶器官，更是在應(yīng)急狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和全身炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)者.因此，腸道作為SIRS和MODS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的樞紐器官越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。研究并揭示SIRS的發(fā)病機(jī)理將對(duì)許多臨床急重癥如創(chuàng)傷、感染、休克、炎癥等的防治起到關(guān)鍵的臨床指導(dǎo)作用。Toll樣受體是一類重要的模式識(shí)別受體（PRRs),它們能識(shí)別相應(yīng)的病原體相關(guān)分子結(jié)構(gòu)（

4、PAMPs），引起炎性介質(zhì)的釋放，并能激活獲得性免疫系統(tǒng)，TLRs介導(dǎo)的天然免疫的這些特點(diǎn)為闡述SIRS的發(fā)病機(jī)理帶來(lái)了希望【5】。
　　TLRs是一種分布于除了免疫細(xì)胞外幾乎全身所有組織細(xì)胞的天然免疫分子，屬于模式識(shí)別受體（PRR），在識(shí)別和防御各種病原微生物侵入及抑制相關(guān)產(chǎn)物的產(chǎn)生方面發(fā)揮著重要作用。病原微生物呈現(xiàn)多種真核細(xì)胞所不具備的具有保守序列的特殊結(jié)構(gòu)，能被TLRs識(shí)別，這類保守結(jié)構(gòu)稱為病原體相關(guān)分子模式（PAMP).T

5、LRs識(shí)別PAMPs后主要通過(guò)NF-kB途徑激活免疫應(yīng)答基因，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的合成與釋放，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)【6-8】。
　　當(dāng)組織器官發(fā)生缺血再灌注（IR）后，受損的組織會(huì)釋放一些內(nèi)源性的危險(xiǎn)物質(zhì)，如低分子量透明質(zhì)酸、纖維蛋白原、纖維蛋白、熱休克蛋白HSP60和HSP70等，這些物質(zhì)被TLRs識(shí)別后，引發(fā)免疫炎癥反應(yīng)【9】。
　　近年來(lái)相關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，TOLL樣受體在炎癥反應(yīng)中的作用越來(lái)越重要，與缺血/再灌注損傷的關(guān)系

6、也越來(lái)越緊密，包括在腦缺血、肺缺血、肝缺血以及腎缺血等中發(fā)揮著重要作用，而目前國(guó)內(nèi)外對(duì)腸缺血/再灌注損傷的體外研究方面的病生理機(jī)制研究相對(duì)不足，從而引發(fā)我們對(duì)這方面的思考，促使本研究的開展。
　　研究目的: 研究TLR2,4,9是否參與了腸道缺血再灌注損傷過(guò)程,從而為新型免疫調(diào)節(jié)劑的研發(fā)提供相關(guān)理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法: 主要是通過(guò)腸上皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧來(lái)模擬腸道缺血再灌注損傷過(guò)程。我們將實(shí)驗(yàn)對(duì)象隨機(jī)分為4組：1.正常細(xì)胞組；2

7、.低氧/復(fù)氧組；3.加配體組；4.加配體低氧/復(fù)氧組，其中TLR9組加入甲基化CpG作為對(duì)照。通過(guò)MTT法來(lái)摸索缺氧時(shí)間和配體加入的濃度和作用時(shí)間，用RT-PCR來(lái)檢測(cè)各組相應(yīng)TLRs的相對(duì)表達(dá)量。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)摸索出的實(shí)驗(yàn)條件為：缺氧條件：1％的O2，5%CO2，94%N2.缺氧時(shí)間：90min,復(fù)氧60min。配體的作用條件：LPS0.3ug/ml;PGN0.5ug/ml;CpG0.5uM,三種配體作用時(shí)間均

8、為12h.
　　RT-PCR結(jié)果顯示TLR2,TLR4,TLR9三組實(shí)驗(yàn)在結(jié)果上顯示出一致性，相對(duì)于正常組，缺氧組TLRs其mRNA表達(dá)量增高，P<0.05，說(shuō)明細(xì)胞缺氧復(fù)氧能激活TLRs；與缺氧組相比，缺氧組和配體混合干預(yù)組其mRNA表達(dá)量進(jìn)一步增高， P<0.05；與正常組（TLR9）相比，（M）CpG-ODN組無(wú)明顯變化，P＞0.05，進(jìn)一步驗(yàn)證TLR9只對(duì)非甲基化CpG起到識(shí)別并激活作用，對(duì)甲基化CpG無(wú)明顯反應(yīng)。