骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)腎臟缺血再灌注損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：急性腎功能衰竭(Acuterenalfailure，ARF)是臨床常見之危重癥，死亡率較高，目前治療方面仍缺乏有效的手段。缺血再灌注損傷引起的急性腎小管壞死是ARF的常見病因，其病理特征為腎小管梗阻、腎小管濾過液回漏和濾過功能障礙。因此促進(jìn)腎小管上皮的再生和腎小管結(jié)構(gòu)的重建是治療ARF的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用缺血再灌注腎臟勻漿和全反式維甲酸對(duì)大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymlstemcells，MSCs)進(jìn)行誘導(dǎo)，探討體外誘導(dǎo)

2、Mscs向腎小管上皮樣細(xì)胞分化的可能性；同時(shí)對(duì)缺血再灌注腎臟損傷的大鼠行MSCs靜脈移植治療，觀察MSCs在大鼠體內(nèi)的分布情況以及對(duì)腎臟修復(fù)的促進(jìn)作用。 方法： 1.體外實(shí)驗(yàn)：采用梯度離心和貼壁篩選法分離純化MSCs，取第三代的MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)。在MSCs的培養(yǎng)液中加入全反式維甲酸，終濃度為5μM；同時(shí)將裝有缺血再灌注損傷大鼠腎臟勻漿的插入式嵌合培養(yǎng)皿置于MSCs的培養(yǎng)板中，以此對(duì)MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，分別于Od、3d、5d

3、、7d時(shí)對(duì)誘導(dǎo)的MSCs細(xì)胞進(jìn)行大體形態(tài)學(xué)觀察、超微結(jié)構(gòu)觀察、細(xì)胞組織化學(xué)染色、胞漿內(nèi)第18型角蛋白(CKl8)流式細(xì)胞儀測(cè)定。 2．體內(nèi)試驗(yàn)：選用72只雌性6周齡SD大鼠進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)將大鼠分為四組：1)正常對(duì)照組(n=6)：觀察正常大鼠血液學(xué)指標(biāo)和。腎組織結(jié)構(gòu)；2)假手術(shù)對(duì)照組(n=6)：行開腹手術(shù)，而不夾閉腎蒂；3)缺血再灌注(I瓜)組(n=30)：夾閉腎蒂45min，建立雙側(cè)腎臟缺血再灌注損傷模型，再灌注60min后

4、，股靜脈輸注生理鹽水；4)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)組(n=30)：夾閉腎蒂45min，建立雙側(cè)腎臟缺血再灌注損傷模型，再灌注60min后，股靜脈輸注經(jīng)5一溴脫氧尿嘧啶核苷(BmU)標(biāo)記的MSCs細(xì)胞懸液(1×106/mD。分別于再灌注后12h、3d、7d、14d、42d隨機(jī)選取I瓜組大鼠和MSCs組大鼠各6只，麻醉下收獲腎臟標(biāo)本和血標(biāo)本。血標(biāo)本經(jīng)全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定腎功能指標(biāo)尿素氮和肌酐值：所有腎臟標(biāo)本常規(guī)病理切片，用HE、PAS染

5、色觀察組織學(xué)變化，TUNEL法檢測(cè)原位凋亡，免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，激光共聚焦顯微鏡觀察MSCs分布及分化情況。 結(jié)果： 1．體外實(shí)驗(yàn)：MSCs經(jīng)誘導(dǎo)后大體形態(tài)變?yōu)閳A形、橢圓形或短胖梭形，細(xì)胞逐漸呈鵝卵石樣排列。經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞CKl8表達(dá)陽性率于Od、3d、5d、7d分別為3．27％、20．5％、38．4％、79．5％，陽性率逐漸升高。誘導(dǎo)第7d細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)微絨毛和緊密連接。MSCs未經(jīng)誘導(dǎo)時(shí)堿性磷酸酶(ALP)染

6、色陽性率為5％，誘導(dǎo)第7d，札P染色明顯增強(qiáng)，陽性率為723％。 2．體內(nèi)試驗(yàn)：再灌注后12h、3d，MSCs組S盯值分別為66．35士23．89pmol/L、34．89±7．19μmol/L與I/R組(分別為146．45士33．74μmol/L、103．8士55．73μmo兒)相比明顯降低(P<0．05)，MSCs組BUN值分別為23．32±4．35mmo兒、6．48士2．25mmo兒與I/R組(分別為31．3士3．93mmo

7、l幾、23．5士12．43mmo兒)相比明顯降低(P

8、Cs組PCNA陽性細(xì)胞數(shù)分別為42．53±7．10、36．43士10．72、49．93士7．61較I/R組(9．87±3．97、lO．10±539、17．8±4．77)明顯增多(P