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文檔簡介
1、目的:本研究擬通過腎臟缺血再灌注損傷動物模型的研究,探討骨髓來源的干細胞在急性腎臟損傷修復中的作用,觀察骨髓來源的干細胞能否分化為腎臟實質(zhì)細胞,深化對干細胞可塑性的認識;觀察骨髓干細胞是否可以轉化為腎祖細胞,明確腎祖細胞的來源;觀察粒細胞集落刺激因子(G-CSF)是否可以有效動員骨髓干細胞進入外周血并向缺血再灌注損傷腎臟歸巢,提高腎臟修復的效能,為急性腎臟損傷的治療探索新方法。
方法:6周齡全身表達綠色熒光蛋白(GFP)的
2、C57BL/6J轉基因小鼠提供骨髓,6-8周齡同種無熒光標記的C57BL/6J小鼠20只作為骨髓受體。在接受骨髓移植前,所有受體小鼠接受致死劑量的γ放射線137Cs照射(放射劑量為8.5Gy),照射結束后2小時內(nèi)靜脈注射2×105骨髓單個核細胞。接受骨髓移植5周后,嵌合體小鼠骨髓重建情況經(jīng)流式細胞儀檢測確認。待骨髓重建完畢后(移植后第6周)所有小鼠均結扎左側腎蒂30min后再開放,建立缺血再灌注動物模型。實驗動物分為兩組:(1)生理鹽水
3、對照組(n=10):缺血再灌注手術前3天至術后4天,皮下注射生理鹽水,0.2ml/d。(2)G-CSF動員組(n=10):缺血再灌注手術前3天至術后4天,皮下注射人重組粒細胞集落刺激因子200μg/kg/d。動員結束后第1天取外周血通過流式細胞儀檢測Sca-1、c-Kit、CD34陽性的干細胞占外周血非紅系細胞的比例。缺血損傷再灌注損傷1周后取腎臟標本行HE染色,采用Vyacheslav等的半定量方法評估腎小管損傷程度。觀察動員組與對照
4、組腎臟病理損傷程度的差異。用膠原酶將腎臟消化為單個細胞通過對Sca-1、c-Kit、CD34等不同干細胞抗原標志物進行熒光染色,流式細胞儀檢測比較兩組腎臟中干細胞含量的差異。缺血再灌注損傷4周后通過組織切片熒光組織化學、免疫組織化學等方法觀察骨髓來源的干細胞在腎臟內(nèi)的分化情況,通過統(tǒng)計腎臟血管內(nèi)皮細胞數(shù)量以及骨髓來源的腎祖細胞數(shù)量來驗證G-CSF動員組與對照組在腎臟損傷修復方面的差異。
結果:G-CSF動員后,外周血流式細
5、胞儀檢測顯示,分別為Sca-1、c-Kit、CD34陽性的三群干細胞占外周血非紅系細胞的比例(3.16%±0.11%、3.78%±0.08%、6.09%±0.13%)均高于對照組(1.67%±0.10%、2.19%±0.06%、2.85%±0.14%),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。缺血再灌注損傷1周后,腎臟細胞流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn),G-CSF動員組的缺血側腎臟中,骨髓來源并且分別表達Sca-1、c-Kit、CD34的干細胞(GFP和
6、干細胞抗原表達雙陽性)的比例(0.86%±0.05%、0.78%±0.11%、0.90%±0.08%)均高于對照組(0.51%±0.06%、0.47%±0.08%、0.43%±0.03%),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);同時動員組的缺血側腎臟中骨髓來源GFP陽性細胞的百分比(13.05%±1.14%)也明顯高于對照組(7.75%±0.58%),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。缺血再灌注損傷4周后的腎臟組織切片經(jīng)CD31、SMA、S
7、ca-1免疫熒光染色,可見骨髓來源的干細胞出現(xiàn)在腎小管間隙和腎小球血管簇,并分化為CD31或SMA陽性的腎臟血管內(nèi)皮細胞,參與損傷后血管新生。在損傷區(qū)域的腎小管中出現(xiàn)骨髓來源表達GFP綠色熒光的細胞,骨髓來源的細胞可以分化為腎小管上皮細胞,參與了腎小管損傷的修復。在腎臟間質(zhì)中還可以觀察到GFP和Sca-1雙陽性的骨髓來源的腎祖細胞。通過對比G-CSF動員組和對照組的腎臟,發(fā)現(xiàn)動員組在缺血缺血再灌注損傷1周后腎小管損傷程度評分分值(1.4
8、6±0.05)明顯低于對照組(2.32±0.16),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。損傷4周后G-CSF動員組的腎臟中表達血管內(nèi)皮標志CD31的細胞數(shù)目(31.30±0.42)高于生理鹽水對照組(20.05±0.58),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。通過對骨髓來源的腎祖細胞的計數(shù)發(fā)現(xiàn)G-CSF動員組中GFP與Sca-1雙陽性的細胞數(shù)(6.00±0.82)多于對照組(3.50±0.58),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
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