缺血性損傷腎臟中骨髓來源腎臟干細(xì)胞的分離、體外培養(yǎng)和鑒定.pdf

1、目的：本研究擬通過建立骨髓移植小鼠腎臟缺血再灌注損傷模型，利用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)研究骨髓來源的干細(xì)胞在遷移到受損腎臟之后能否轉(zhuǎn)變?yōu)槟I臟干細(xì)胞，并觀察粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)能否促進(jìn)這種轉(zhuǎn)變作用；觀察從受損腎臟分離的骨髓來源腎臟干細(xì)胞能否在體外擴(kuò)增，并對其表型進(jìn)行鑒定，為骨髓來源細(xì)胞治療腎臟損傷提供新的理論依據(jù)。
　　方法：我們利用系統(tǒng)表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的C57BL/6J轉(zhuǎn)基因小鼠作為供體提供骨髓，無熒光標(biāo)記的受體小鼠經(jīng)

2、致死劑量137Cs照射去除骨髓后接受供體的骨髓移植。骨髓移植(BMT)模型構(gòu)建成功后，我們對受體小鼠施加單側(cè)腎臟缺血再灌注(I/R)損傷，通過流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)研究腎臟I/R損傷后不同時(shí)間點(diǎn)骨髓來源細(xì)胞/干細(xì)胞向受損腎臟遷移情況，并檢測受損腎臟中GFP+CD45+細(xì)胞的比例變化，提供骨髓來源干細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟I臟干細(xì)胞的證據(jù)。其中我們根據(jù)是否施加G-CSF動(dòng)員骨髓來源細(xì)胞而對受體小鼠進(jìn)行分組，即G-CSF組和鹽水(Saline)組。此外，我們從雙

3、側(cè)腎臟I/R損傷后2個(gè)月的小鼠體內(nèi)離體、消化腎臟獲取腎臟細(xì)胞，并進(jìn)行體外培養(yǎng)。我們觀察腎臟細(xì)胞中GFP+細(xì)胞的體外擴(kuò)增能力，并對這些骨髓來源腎臟干細(xì)胞的表型進(jìn)行鑒定。而且，我們還評(píng)價(jià)了體外培養(yǎng)體系中纖維粘連蛋白(Fn)對于這種細(xì)胞貼壁能力和增殖潛能的影響。
　　結(jié)果：BMT后4周，受體小鼠外周血GFP+細(xì)胞的比例為81.83％-97.31％(90.93±3.19％)。G-CSF動(dòng)員后，外周血干細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)情況，G-CSF組C

4、D90、CD133和FLK-1比例(11.38±0.81％、8.95±0.80％和2.20±0.29％)明顯高于Saline組(2.11±0.60％、2.12±0.66%和1.38±0.30％)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。I/R損傷后，遷移到腎臟的骨髓來源(GFP+)細(xì)胞逐漸增多，在早期(14天)，GFP+細(xì)胞比例在Saline組對側(cè)腎臟(SCK)為2.75±0.55％，Saline組缺血側(cè)腎臟(SIK)為5.77±0.33％，G-CSF組對側(cè)

5、腎臟(GCK)為2.40±0.35％，G-CSF組缺血側(cè)腎臟(GIK)為4.72±0.4.6％。SIK>SCK，GIK>GCK，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SIK>GIK，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。損傷后28天，腎臟內(nèi)GFP+細(xì)胞比例在SCK、SIK、GCK、GIK分別為3.35±0.35％、9.43±0.43%、6.15±0.37％、15.98±1.22％。SIK>SCK，GIK>GCK，GIK>SIK，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。損傷后56天，GFP+細(xì)胞向

6、腎臟內(nèi)遷移情況與損傷后28天相似。I/R損傷后，遷移到腎臟的骨髓來源干細(xì)胞(GFP+Sca-1+)逐漸增多，在損傷后的早期(14天以內(nèi))，G-CSF組和Saline組，缺血側(cè)腎臟GFP+Sca-1+細(xì)胞比例均高于對側(cè)腎臟，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在腎臟缺血損傷后28天，SCK、SIK、GCK和GIK中GFP+Sca-1+細(xì)胞比例分別為1.75±0.30％、5.15±0.75％、2.60±0.60％和9.55±1.32％。SIK>SCK，GIK

7、>GCK，GIK>SIK，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。損傷后56天，GFP+Sca-1+細(xì)胞向腎臟遷移情況與損傷后28天相似。此外，腎臟內(nèi)GFP+CD133+和GFP+CD44+細(xì)胞的表達(dá)趨勢與GFP+Sca-1+細(xì)胞相似。腎臟損傷后14天，G-CSF組和Saline組，缺血側(cè)腎臟GFP+CD45+細(xì)胞均高于對側(cè)腎臟，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。損傷后28天，SCK、SIK、GCK和GIK中GFP+CD45+細(xì)胞比例分別為2.25±0.35％、7.50±

8、0.31％、4.42±0.43％和13.00±1.03％。SIK>SCK，GIK>GCK，GIK>SIK，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。損傷后56天，SCK、SIK、GCK和GIK中GFP+CD45+細(xì)胞的表達(dá)比例分別為4.72±0.69％、2.20±0.39％、3.00±0.54％和1.70±0.26％。SCK>SIK，GCK>GIK，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SIK>GIK，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。損傷后56天，GIK和SIK中GFP+CD45+細(xì)胞與28

9、天時(shí)相比，表達(dá)水平均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；GCK中這類細(xì)胞的表達(dá)水平下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而SCK中此類細(xì)胞表達(dá)水平上升，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　體外培養(yǎng)過程中，骨髓來源腎臟干細(xì)胞為圓形或類圓形，可形成集落或聚集成團(tuán)生長，體外擴(kuò)增超過30天。PO-P6代，腎臟細(xì)胞中GFP+細(xì)胞比例逐漸增加，骨髓來源腎臟干細(xì)胞(GFP+Sca-1+)比例逐漸增加。體外培養(yǎng)中骨髓來源腎臟干細(xì)胞CD45的表達(dá)水平比成體新分離時(shí)降低，且不表達(dá)C

10、D34和CD90。與未鋪Fn的培養(yǎng)體系相比，F(xiàn)n鋪盤的培養(yǎng)條件下，每長滿一代所需時(shí)間明顯減少(5.40±0.46天vs.8.33±0.81天)，GFP+細(xì)胞(主要為骨髓來源腎臟干細(xì)胞)比例顯著增加(1.96±0.24％vs.0.92±0.17％)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：1)G-CSF可有效動(dòng)員骨髓來源干細(xì)胞釋放入外周血，并可增加骨髓來源細(xì)胞/干細(xì)胞向損傷后腎臟歸巢的程度；2)腎臟損傷后晚期，骨髓來源干細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟I臟干細(xì)胞