大鼠去細(xì)胞腎臟支架誘導(dǎo)損傷腎臟再生的研究.pdf

1、本文主要從以下兩個部分展開論述：
　　第一部分 去細(xì)胞腎臟支架的制備及檢測
　　目的:
　　制備去細(xì)胞腎臟支架，檢測其相關(guān)特性，為誘導(dǎo)損傷腎臟的再生奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　采用腹主動脈灌注法，依次灌注Triton X-100、SDS等去污劑，制備SD大鼠去細(xì)胞腎臟支架。H&E、PAS及Masson染色觀察去細(xì)胞腎臟支架內(nèi)細(xì)胞成分是否去除，以及ECM結(jié)構(gòu)是否完整;SEM觀察去細(xì)胞腎臟支架內(nèi)微細(xì)結(jié)構(gòu)的完整性

2、，如Bowman氏囊、腎小球基底膜等是否保留;血管鑄型觀察支架內(nèi)各級腎血管的結(jié)構(gòu);紫外-可見分光光度法檢測腎臟支架內(nèi)SDS的殘留量;ELISA定量檢測腎臟支架內(nèi)IL-8、FGF、HGF、CTGF、TGF-β、VEGF以及PDGF等細(xì)胞因子的含量。
　　結(jié)果:
　　SD大鼠腎臟去細(xì)胞支架外觀呈半透明膠凍狀，H&E、PAS、Masson染色未觀察到細(xì)胞核成分，而細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)未見斷裂。SEM觀察到支架內(nèi)Bowman氏囊、腎小球基

3、底膜及腎內(nèi)動靜脈等結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)完好。血管鑄型觀察到腎內(nèi)各級動靜脈結(jié)構(gòu)完整，未受損。紫外-可見分光光度法檢測到支架內(nèi)SDS的含量約為50.0±1.7μg/g，低于毒性范圍(133μg/g)。ELISA定量檢測到支架內(nèi)各種細(xì)胞因子的含量如下:IL-843.99 ng/L，F(xiàn)GF63.7 ng/L，HGF25.92 ng/L，CTGF68.235ng/L, TGF-β96.835ng/L, VEGF207.7ng/L, PDGF983.58

4、5 ng/L。
　　結(jié)論:
　　通過血管灌注法能夠制備外觀通透的去細(xì)胞腎臟支架，其內(nèi)細(xì)胞成分完全去除，而細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)保存完好，微細(xì)結(jié)構(gòu)未受損，腎內(nèi)各級血管結(jié)構(gòu)完整。支架內(nèi)各種細(xì)胞因子均有一定程度的保留。支架內(nèi)的去污劑含量極低，位于正常安全值范疇內(nèi)。
　　第二部分 去細(xì)胞腎臟支架誘導(dǎo)損傷腎臟再生的研究
　　目的:
　　探索去細(xì)胞腎臟支架能否誘導(dǎo)損傷腎臟的再生。
　　方法:
　　選取8周齡雄性SD

5、大鼠（重約250g）行水合氯醛腹腔麻醉后，開腹行左側(cè)腎臟下半部分切除術(shù)。實驗組:應(yīng)用去細(xì)胞腎臟支架對部分切除腎臟創(chuàng)面進(jìn)行斷面-斷面吻合;對照組:直接縫合創(chuàng)傷腎臟的斷面。術(shù)后1周、2周、4周、8周對兩組動物進(jìn)行腎臟B超探查觀察左側(cè)腎臟的大小及血流變化情況;行99mTc-DTPA腎動態(tài)顯像測定實驗動物的雙側(cè)腎小球濾過率。各時間點處死實驗動物，對左側(cè)腎臟進(jìn)行大體觀察，比較腎臟的大小;石蠟包埋連續(xù)切片行H&E染色，觀察損傷腎臟的病理變化;石蠟切

6、片免疫熒光雙標(biāo)nestin、AQP-1觀察腎內(nèi)干細(xì)胞、近曲腎小管上皮細(xì)胞的變化情況，并用Image Pro-Plus進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　實驗組動物的左側(cè)腎臟可見手術(shù)縫線明顯下移，腎臟實質(zhì)明顯增大，而對照組并未見到這一現(xiàn)象。B超可見移植支架區(qū)域有明顯血流信號通過。腎動態(tài)顯像示:術(shù)后6周，實驗組左腎的GFR明顯高于對照組GFR。病理切片H&E染色觀察示:實驗組腎臟手術(shù)切緣處的腎實質(zhì)呈現(xiàn)損傷-損傷后修復(fù)性再生的病理變化，移

7、植支架區(qū)域呈現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤-支架肉芽化的變化。免疫熒光觀察到，實驗組腎臟再生區(qū)域nestin在術(shù)后1周主要表達(dá)于再生區(qū)域的腎小球及腎小管，2周時在腎小管的表達(dá)逐漸減少，8周時僅在腎小球表達(dá)。經(jīng)Image Pro-Plus分析，知nestin在實驗組的表達(dá)強于對照組。AQP-1的熒光結(jié)果示:術(shù)后1周、2周均無法檢測到，4周時恢復(fù)表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　去細(xì)胞腎臟支架能夠誘導(dǎo)損傷腎臟的切緣腎實質(zhì)再生，移植的去細(xì)胞支架逐漸變成肉芽