腎臟急性缺血再灌注損傷的代謝組學(xué)研究.pdf

1、急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是指由導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)或功能變化的損傷引起的腎功能突然(48小時(shí)以內(nèi))下降,是心臟、大血管、肝移植等外科手術(shù)、膿毒血癥及ICU重癥患者的常見并發(fā)癥,亦可由常見醫(yī)療干預(yù)(造影劑、氨基糖甙類抗生素、非甾體類抗炎藥等)引起,基于住院患者的流行病學(xué)調(diào)查顯示其發(fā)病率可達(dá)7.2％,其中有慢性腎臟病基礎(chǔ)的患者發(fā)病率更可高達(dá)15.7％,社區(qū)獲得性ARF的患病率也達(dá)到0.4％,其進(jìn)展嚴(yán)重影響患者生存

2、質(zhì)量及預(yù)后。AKI的臨床診療中,存在診斷和治療的雙重缺陷,首先,診斷主要依靠血肌酐和尿量,但是,血肌酐并不是一個(gè)敏感的指標(biāo),而且血肌酐和尿量都容易受腎功能以外多種因素的影響；治療方面,血液透析技術(shù)是目前對(duì)重癥急性腎損傷最重要的治療措施之一,缺乏有效的針對(duì)病因的治療干預(yù),患者預(yù)后不佳。因此,探明急性腎損傷的發(fā)病機(jī)制并尋找早期預(yù)防措施己成為腎臟病及急救醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的前沿課題之一。代謝組學(xué)是在細(xì)胞、組織或器官新陳代謝的動(dòng)態(tài)進(jìn)程中,研究所有代謝組分

3、尤其指小分子物質(zhì)的變化規(guī)律的一門新興科學(xué)。由于代謝(物)處于生物系統(tǒng)生化活動(dòng)調(diào)控的末端,包含著反映生理表型的直接而全面的生物標(biāo)記物(biomarker)信息,因此,代謝組學(xué)日益成為整體性研究生命體系功能變化的非常有力的分析手段。 臨床流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),各種原因引起的灌注不足是急性腎損傷最常見的病,因此本研究首先建立AKI的急性缺血再灌注損傷大鼠模型。采用夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈45分鐘的方法造成缺血再灌注損傷,收集大鼠術(shù)前及術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)

4、血清和術(shù)后1、2、3、4天的24小時(shí)尿液。大鼠術(shù)后全部存活,腎功能迅速下降,尿量增多,腎臟增大,腎重/體重增加,組織學(xué)表現(xiàn)出急性腎小管壞死,符合腎臟急性缺血再灌注損傷的表現(xiàn)。與以往一側(cè)腎切除、一側(cè)腎缺血及結(jié)扎雙側(cè)腎蒂的造模方法相比,雙側(cè)腎動(dòng)脈夾閉的缺血再灌注損傷模型無(wú)腎臟切除帶來(lái)的神經(jīng)內(nèi)分泌影響,僅為動(dòng)脈缺血而無(wú)靜脈、輸尿管阻塞,更能模擬臨床因外科手術(shù)、心衰、肝硬化等造成的腎臟低灌注情況。 在成功制造急性腎臟缺血再灌注損傷動(dòng)物模

5、型的基礎(chǔ)上,本研究采用RRLC/Q-TOF-MS對(duì)動(dòng)物血清標(biāo)本就行了代謝產(chǎn)物的檢測(cè)。應(yīng)用快速分辨率液相色譜RRLC 1200,C18 XDB色譜柱(2.1mm×100mm,1.8μm,美國(guó)Agilen公司)進(jìn)行高效液相色譜分析,6510 Q-TOF質(zhì)譜正離子模式進(jìn)行代謝物的鑒定。RRLC/MS在血清中檢測(cè)到大量代謝產(chǎn)物,每個(gè)樣本檢測(cè)到的特征(-對(duì)質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間,代表一種物質(zhì))都在1500個(gè)以上,應(yīng)用主成份分析法(principle c

6、omponentanalysis,PCA)和偏最小二乘法-判別分析(Partial Least Squares-Discriminanlanalysis,PLS-DA)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析,產(chǎn)生得分圖(score plot)和載荷圖(loadingplot),其中得分圖顯示,在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)得分圖中,缺血再灌注組和對(duì)照組能夠完全分開,術(shù)后2小時(shí),缺血再灌注和對(duì)照組即有明顯不同,早于血清肌酐和尿素氮的變化,表明代謝組學(xué)的圖形識(shí)別技術(shù)可以早期診斷急

7、性腎損傷。 對(duì)圖形區(qū)分產(chǎn)生貢獻(xiàn)的物質(zhì)組成載荷圖,檢索Metlin數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些物質(zhì)進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)對(duì)區(qū)分缺血再灌注組和對(duì)照組貢獻(xiàn)最大的物質(zhì)主要有兩類：(1)磷脂酰膽堿類分解代謝產(chǎn)物,這類物質(zhì)在缺血再灌注動(dòng)物血清中的含量有不同程度的增高,提示在該組動(dòng)物組織內(nèi)磷脂酶的激活；(2)卡尼汀及其衍生物：缺血再灌注動(dòng)物血清中,卡尼汀及短鏈脂?？嵬舛冉档?而棕櫚酰卡尼汀濃度增高,提示在缺血再灌注過(guò)程中,卡尼汀消耗增加,且存在內(nèi)源性卡尼汀的不足

8、。 在此基礎(chǔ)上,本文用大劑量的左旋卡尼汀對(duì)急性缺血再灌注損傷進(jìn)行干預(yù),實(shí)驗(yàn)分三個(gè)內(nèi)容：第一,預(yù)防性給予左旋卡尼汀能否有效保護(hù)腎臟缺血再灌注損傷；第二,探討缺血再灌注損傷保護(hù)的機(jī)制；第三,再灌注后延遲給予左旋卡尼汀是否有保護(hù)作用。結(jié)果表明在術(shù)前預(yù)防性給藥或在再灌注開始時(shí)給藥可成功保護(hù)腎臟急性缺血再灌注損傷,大鼠術(shù)后多尿現(xiàn)象改善,血清肌酐、尿素氮較手術(shù)組顯著降低,腎臟水腫淤血現(xiàn)象改善,小管壞死評(píng)分顯著降低,TUNEL陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)目

9、降低。進(jìn)一步探討其機(jī)制發(fā)現(xiàn),早期給予左旋卡尼汀可防止Bax轉(zhuǎn)位至線粒體,增加線粒體Bcl-2與線粒體外膜的聯(lián)系,減少線粒體細(xì)胞色素C的釋放,并可防止線粒體膜電位的下降,表明左旋卡尼汀對(duì)腎臟的保護(hù)作用可能與其降低線粒體膜通透性有關(guān)。 綜上,本研究發(fā)現(xiàn),代謝組學(xué)能夠在2-72小時(shí)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)區(qū)分對(duì)照組和缺血再灌注損傷組血清,代謝物譜能夠早于血清肌酐、尿素氮的變化而發(fā)現(xiàn)腎臟損傷；差異代謝產(chǎn)物主要有磷脂酰膽堿分解代謝產(chǎn)物,卡尼汀及其衍生