人類臍帶源性的間質(zhì)干細胞減輕了缺血再灌注損傷引發(fā)的急性和慢性腎臟損傷.pdf

1、第一部分
　　人類臍帶源性的間質(zhì)干細胞經(jīng)內(nèi)分泌途徑減輕由缺血再灌注損傷引發(fā)的急性和慢性腎臟損傷
　　目的
　　評估人類臍帶源性的間質(zhì)干細胞(WJ-MSCs)能否減輕缺血再灌注損傷(IRI)導致的急性和慢性腎臟損傷并探討其背后潛在的機制。
　　方法
　　建立IRI動物模型，實施右腎切除，左腎缺血45分鐘;IRI后立即經(jīng)尾靜脈注入含或不含2×106細胞的無血清培養(yǎng)基(SFM)0.5ml;在遭受IRI后2天或22

2、周時犧牲動物，分別測定血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)值;2天時，腎小管細胞的增殖、凋亡以及細胞內(nèi)Akt信號的活化通過免疫組織化學染色(IHC)評估;實時熒光定量PCR(RT-PCR)用來確定腎組織樣本中抗炎因子白介素-10(IL-10)和血紅素氧化酶-1(HO-1)以及肝細胞生長因子(HGF)的基因表達;采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定血清和細胞上清液中的人HGF水平;急性損傷后22周時發(fā)生的腎纖維化經(jīng)組織膠原染色(Mass

3、on'stri-chromestaining)、旺-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)染色以及膠原定量(Sircolcollagenassay)確定。
　　為確定輸注細胞在體內(nèi)分布，體外BrdU標識的細胞在IRI后即刻注入，分別在2、24或48小時后犧牲動物;獲取各臟器組織提交IHC(BrdU和人核有絲分裂器抗原(NuMA)染色）用于細胞定位;為確定細胞作用途徑，在損傷后立即經(jīng)腹腔或靜脈注入含或不含細胞的SFM0.5ml，24或48小時

4、后采集血清測定Scr和BUN水平。
　　結(jié)果
　　IRI后2天時出現(xiàn)急性腎功能衰竭，在細胞干預下，腎功能明顯改善;組織學上，細胞治療促進了小管細胞增殖并抑制其凋亡;此外，小管細胞內(nèi)的Akt信號也得到顯著強化;研究還發(fā)現(xiàn)細胞治療引發(fā)腎組織中抗炎因子IL-10和HO-1以及HGF表達上調(diào);此外，在細胞上清液和細胞治療動物的血清中均探測到人HGF;在損傷后22周時，細胞干預改善了腎功能并減輕腎纖維化、阻止小管細胞向間質(zhì)表型(α-S

5、MA)的轉(zhuǎn)化。
　　在細胞輸注后2、24或48小時，BrdU標識細胞僅在肺部探測到，肝、脾和腎臟均未探測到細胞存在;利用NuMA染色進行細胞定位得到了相同的結(jié)果;在損傷后24或48小時，WJ-MSCs，無論是腹腔注射還是靜脈注射，均顯著改善了腎臟功能。
　　結(jié)論
　　WJ-MSCs經(jīng)內(nèi)分途徑減輕了IRI引發(fā)的急性和慢性腎臟損傷;由細胞投遞的外源性HGF和誘導宿主細胞合成的內(nèi)源性HGF是其效應的潛在機制之一。
　　

6、第二部分
　　人類臍帶源性間質(zhì)干細胞通過誘導受損大鼠腎小管上皮細胞合成同種和異種肝細胞生長因子減輕缺血再灌注損傷引發(fā)的腎纖維化
　　目的
　　基于前期文獻，研究試圖從全新的角度來揭示人類臍帶源性的間質(zhì)干細胞(WJ-MSCs)減輕急性腎損傷(AKI)引發(fā)的慢性腎纖維化的機制，即誘導受損的腎小管上皮細胞(TECs)合成肝細胞生長因子(HGF)。
　　方法
　　通過單側(cè)腎臟缺血1小時建立AKI動物模型:2天后，經(jīng)

7、尾靜脈注入含或不含2x106細胞的無血清培養(yǎng)基(SFM)0.5ml或?qū)嵤?cè)腎臟切除手術;在不同干預治療后1天、1周、4周或6周時分別犧牲大鼠;腎臟纖維化經(jīng)Masson'stri-chromestaining和Sircolcollagenassay進行評估;α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)相對E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的表達上調(diào)(免疫蛋白印跡(westernblot)和免疫組織化學染色(IHC))用來提示腎小管上皮細胞向間質(zhì)表

8、型的轉(zhuǎn)化(EMT);HGF和轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)的基因和蛋白表達分別經(jīng)實時熒光定量PCR(RT-PCR)和westernblot確定;HGF在腎組織中的表達部位經(jīng)IHC確定;在體外，TECs暴露于低氧環(huán)境(5％O2)1小時后與來自WJ-MSCs的條件培養(yǎng)基(CM)或SFM共同孵育1、3、24或48小時;由TECs合成或釋放的大鼠或人類HGF經(jīng)RT-PCR、IHC或ELISA確定。
　　結(jié)果
　　細胞投遞或?qū)?cè)腎臟

9、的切除明顯減輕了損傷腎的纖維化;在AKI初始階段（1周時），通過誘導HGF表達，細胞治療或腎臟切除引發(fā)患腎組織內(nèi)HGF相對TGF-β1的表達顯著上調(diào);大鼠TECs不僅是表達HGF的主要細胞而且在細胞治療或腎切后，TECs內(nèi)的HGF表達明顯強化;在AKI的纖維化階段（4周或6周時），細胞干預或腎臟切除阻止HGF對TGF-β1表達的下調(diào)，并藉此阻止了EMT;在體外實驗中，CM與遭受低氧損害的TECs共同孵育24或48小時后，強力誘導了TEC

10、s內(nèi)大鼠HGF基因表達的上調(diào)，同時促進了TECs釋放HGF;此外，在共同孵育3小時后，在TECs內(nèi)探測到人HGFmRNA的存在;在24或48小時后，人類HGF蛋白出現(xiàn)在大鼠TECs中。
　　結(jié)論
　　在AKI背景下，WJ-MSCs延緩了損傷觸發(fā)的腎小管上皮細胞的EMT進程，并籍此減輕了腎臟纖維化;在AKI初始階段，異種間質(zhì)干細胞(WJ-MSCs)通過誘導受損宿主TECs合成同種及異種HGF促進了急性腎損傷修復、減輕了其后的慢