人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞分泌的微囊減輕大鼠缺血再灌注引發(fā)的急、慢性腎損傷的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞分泌的微囊通過抑制NOX2的表達(dá)減輕氧化應(yīng)激改善缺血再灌注引發(fā)的急、慢性腎損傷
　　目的:
　　評(píng)估人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human Wharton-Jelly mesenchymal stromal cells，huWJ-MSC)分泌的微囊(micro-vesicles，MVs)對(duì)大鼠缺血再灌注引發(fā)的急慢性損傷的治療作用，并進(jìn)一步探討其潛在機(jī)制。
　　方法:
　　從人類臍帶內(nèi)分離培養(yǎng)臍帶間

2、充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)3-6代后無血清饑餓24小時(shí)后取其條件培養(yǎng)基(conditional medium，CM)，應(yīng)用差速離心法從中分離提純微囊，并蛋白定量。8周齡成年SD大鼠分為假手術(shù)組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，并建立單側(cè)腎臟缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)模型（保留右腎，左腎缺血1小時(shí)后再灌注）;實(shí)驗(yàn)組再灌注時(shí)立即從尾靜脈注射100μg MVs，對(duì)照組注射相同容積的M199細(xì)胞培養(yǎng)液。分別在再灌注后

3、24小時(shí)，48小時(shí)及2周處死動(dòng)物，取腎臟及血液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè);
　　腎臟組織切片行HE染色以評(píng)估腎臟損傷形態(tài)學(xué)變化并進(jìn)行評(píng)分;應(yīng)用DCFH-DA法檢測(cè)腎臟組織內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)濃度;應(yīng)用檢測(cè)腎臟組織內(nèi)丙二醛(Malondialdehyde，MDA)濃度來評(píng)估脂質(zhì)過氧化程度;應(yīng)用8-OHdG免疫組織化學(xué)染色評(píng)估腎臟組織內(nèi)核酸受活性氧損傷情況;應(yīng)用Oxyblot法檢測(cè)腎臟組織內(nèi)蛋白質(zhì)受活性

4、氧損傷情況;應(yīng)用TUNNEL染色法評(píng)估腎臟組織內(nèi)細(xì)胞凋亡情況，同時(shí)應(yīng)用Ki67免疫組織化學(xué)染色評(píng)估腎臟組織內(nèi)細(xì)胞增殖情況;腎臟組織內(nèi)NOX2表達(dá)情況應(yīng)用Western-blot和免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行評(píng)估;
　　為評(píng)估受損腎臟功能和腎臟纖維化程度，將動(dòng)物再灌注后第十二天切除右側(cè)腎臟，2周時(shí)處死前抽取下腔靜脈血檢測(cè)尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)濃度;獲取腎臟組織進(jìn)行Masson's三色染色以及α-SMA的表達(dá)檢測(cè);
　　體外

5、實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞系NRK-52E和人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs，以低氧損傷6小時(shí)后行MVs或M-199處理48小時(shí)，應(yīng)用免疫細(xì)胞熒光染色和Western-blot法檢測(cè)NOX2的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)MVs治療后IRI腎臟組織學(xué)損傷評(píng)分明顯改善;再灌注后24小時(shí)和48小時(shí)在蛋白水平，核酸水平及膜脂質(zhì)過氧化水平的氧化應(yīng)激均得到減輕，腎臟組織內(nèi)增殖細(xì)胞增多并且凋亡細(xì)胞減少，腎臟組織內(nèi)NOX2蛋白

6、表達(dá)水平下降并且腎臟組織內(nèi)的活性氧水平降低;在再灌注后兩周，腎臟經(jīng)MVs治療后纖維化水平下降，腎臟功能得到改善;
　　體外實(shí)驗(yàn)中經(jīng)缺氧受損的NRK-52E和HUVEC的NOX2表達(dá)增高，經(jīng)MVs處理后NOX2表達(dá)降低。
　　結(jié)論:
　　單次靜脈應(yīng)用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的MVs可以在缺血再灌注后早期保護(hù)腎臟，并且還可以在后期減輕腎臟纖維化以及改善腎臟功能;其機(jī)制可能是通過抑制NOX2的表達(dá)減輕腎臟組織內(nèi)氧化應(yīng)激水平。<

7、br>　　第二部分間充質(zhì)干細(xì)胞來源的微囊比條件培養(yǎng)基可能有更強(qiáng)的治療作用:鼠類急性腎損傷模型的Meta分析
　　背景:
　　目前在間充質(zhì)干細(xì)胞治療各種原因引發(fā)的急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)的研究中，內(nèi)分泌/旁分泌機(jī)制已經(jīng)越來越受到重視;在本研究中，我們對(duì)關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(conditioned medium，CM)或者間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外微囊(extracellular-ves

8、icles，Evs)對(duì)各種原因引發(fā)的鼠類（大鼠及小鼠）急性腎損傷的治療作用的文獻(xiàn)做了系統(tǒng)性綜述，以肌酐為指標(biāo)做了相關(guān)的Meta分析。
　　方法:
　　應(yīng)用我們既定的檢索策略，在PubMed和Scopus數(shù)據(jù)庫(kù)檢索相關(guān)文獻(xiàn)，根據(jù)既定排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選得到相關(guān)文獻(xiàn);提取文獻(xiàn)中相關(guān)信息，包括基線血清肌酐值、治療前后血清肌酐值、是條件培養(yǎng)基或者微囊治療、治療途徑(deliveryrout)、治療時(shí)間(therapeutic time

9、point)、肌酐測(cè)量時(shí)間(measurement time point)、急性腎損傷的模型以及其他相關(guān)的參數(shù)等;對(duì)治療前后的肌酐差值行匯總分析(pooled analysis)，根據(jù)不同處理行亞組分析（sub-group analysis）和多變量Meta回歸分析(multivariable Meta-regression analysis)，同時(shí)對(duì)于異質(zhì)性的來源和發(fā)表偏倚也做了探討。
　　結(jié)果:
　　通過文獻(xiàn)檢索和篩選，

10、總共有13篇文獻(xiàn)納入本研究;匯總分析發(fā)現(xiàn)，在鼠類（大鼠或小鼠）的急性腎損傷模型中，經(jīng)條件培養(yǎng)基/微囊治療后血清肌酐值下降(0.93[1.20，0.67]， mg/dL);經(jīng)過亞組分析發(fā)現(xiàn)，微囊比條件培養(yǎng)基具有更強(qiáng)的治療作用(P=0.05);其他可影響治療治療后肌酐下降值的重要因素包括肌酐測(cè)量時(shí)間(P=0.0004)以及治療時(shí)間點(diǎn)(P＜0.0001);而其他因素如治療途徑、急性腎損傷的模型、細(xì)胞類型等皆不是影響治療效果的重要因素(P＞0.

11、05);此外，多元Meta回歸分析表明，測(cè)量時(shí)間點(diǎn)(P=0.041)，治療時(shí)間點(diǎn)(P=0.03)，Ev值或CM(P=0.0003)和細(xì)胞類型(P＜0.0001)是異質(zhì)性的起源。
　　結(jié)論:
　　本研究通過Meta分析證實(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞來源的微囊或者條件培養(yǎng)基對(duì)急性腎損傷誘發(fā)的腎功能損害有治療作用;與條件培養(yǎng)基相比較，微囊對(duì)急性腎損傷具有更明顯的治療作用;此外，在應(yīng)用條件培養(yǎng)基或微囊治療急性腎損傷時(shí)，較早的干預(yù)可能會(huì)取得相對(duì)較