人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)巨噬細(xì)胞參與修復(fù)腎缺血再灌注損傷研究.pdf

1、目的:間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植對(duì)缺血-再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)等造成的腎組織損傷具有保護(hù)和促修復(fù)作用，是一種有效的細(xì)胞替代療法，然而其確切的作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討MSCs對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，以及巨噬細(xì)胞在MSCs發(fā)揮腎保護(hù)性作用機(jī)制中的影響，從而揭示一種新的間質(zhì)干細(xì)胞移植治療腎損傷的機(jī)制，為MSCs的臨床應(yīng)用提供必要的理論基礎(chǔ)與依據(jù)。

2、>　　 方法:采用人臍帶來(lái)源的間質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hucMSCs)，經(jīng)尾靜脈移植治療C57BL/6小鼠腎缺血-再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)模型，并分別于術(shù)前、再灌注后1～10天內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)動(dòng)態(tài)收集小鼠血液、組織標(biāo)本，觀察hucMSCs的腎保護(hù)作用并探討機(jī)制。采用紅色熒光染料CM-Dil標(biāo)記技術(shù)，對(duì)hucMSC

3、s進(jìn)行體內(nèi)示蹤定位。檢測(cè)小鼠血清中肌酐(creatinine，Cr)與尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平，評(píng)價(jià)hucMSCs治療前后I/R損傷小鼠的腎功能改善情況。腎組織切片H&E染色及小管損傷評(píng)分揭示hucMSCs對(duì)腎組織結(jié)構(gòu)完整性的保護(hù)作用。通過(guò)PCNA免疫染色以及TUNEL分析hucMSCs移植對(duì)腎組織細(xì)胞增殖、凋亡的影響。免疫組織化學(xué)法對(duì)各組動(dòng)物腎臟中F4/80+巨噬細(xì)胞進(jìn)行染色，評(píng)價(jià)hucMSCs處理

4、前后I/R損傷腎組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量的改變。同時(shí)，經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測(cè)腎臟中單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protine-1，MCP-1)的表達(dá)，從損傷微環(huán)境中趨化因子的角度初步探討hucMSCs影響巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的可能機(jī)制。流式分析腎組織中CD206+細(xì)胞占CD11b+巨噬細(xì)胞的百分比，評(píng)價(jià)hucMSCs對(duì)體內(nèi)巨噬細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)換的作用。通過(guò)尾靜脈注射脂質(zhì)體包裹的氯膦酸鹽(liposome-d

5、ichloromethylene bisphosphonate，lipo-Cl2MBP)清除動(dòng)物模型內(nèi)的單核一巨噬細(xì)胞，再經(jīng)腎組織病理切片觀察其對(duì)hucMSCs發(fā)揮損傷修復(fù)作用的影響。采用定量RT-PCR分析hucMSCs治療前后以及巨噬細(xì)胞清除后小鼠腎組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-10的mRNA水平，研究損傷局部炎癥狀態(tài)的改變。在體外，將RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞株與hucMSCs共培養(yǎng)，分別檢測(cè)了巨噬細(xì)胞的免疫表型及炎

6、癥因子的表達(dá)。流式細(xì)胞儀分析共培養(yǎng)后RAW264.7細(xì)胞表面M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD206的表達(dá)情況;RT-PCR及ELISA分析RAW264.7細(xì)胞中炎癥因子IL-1β、IL-6、arginase-1和IL-10的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:hucMSCs經(jīng)尾靜脈注射后，可遷移、定位至小鼠肺臟與損傷腎臟的局部。hucMSCs治療組小鼠各時(shí)間點(diǎn)血清Cr、BUN水平明顯下降，腎組織損傷程度減輕，且腎小管細(xì)胞的增殖加速、凋

7、亡減少。hucMSCs治療組小鼠與PBS對(duì)照組相比，其腎組織中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯減少，以再灌注后5天改變最為顯著。同時(shí)，免疫組織化學(xué)分析表明I/R損傷的腎小管上皮細(xì)胞高表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞有趨化作用的因子MCP-l，而hucMSCs處理可降低該因子在腎組織中的表達(dá)。對(duì)IRI晚期（再灌注后5天）腎組織中巨噬細(xì)胞的免疫學(xué)分型進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，hucMSCs治療組與PBS對(duì)照組相比，其腎組織中具有促修復(fù)作用的M2型巨噬細(xì)胞比例明顯增加。清除I

8、/R損傷早期小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞，對(duì)hucMSCs的組織修復(fù)具有明顯的促進(jìn)作用;相反，對(duì)IRI晚期體內(nèi)巨噬細(xì)胞的清除則可抑制hucMSCs的腎保護(hù)性作用。定量RT-PCR結(jié)果顯示，hucMSCs治療組的促炎因子合成減少而抑炎因子表達(dá)增高，具有緩解損傷局部炎癥的作用。體外與hucMSCs非接觸共培養(yǎng)(Transwell)或直接接觸培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞株RAW264.7，其CD206表達(dá)水平明顯高于RAW264.7細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組，且炎癥因子IL-1β

9、、IL-6表達(dá)降低，arginase-1與IL-10表達(dá)升高。
　　 結(jié)論:hucMSCs移植對(duì)C57BL/6小鼠的腎缺血-再灌注損傷具有保護(hù)及促修復(fù)作用。該治療作用的發(fā)揮與其減少腎組織內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，加速損傷局部炎癥消退以及促進(jìn)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換有關(guān)。hucMSCs通過(guò)對(duì)損傷局部以及體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中巨噬細(xì)胞免疫表型以及炎癥因子表達(dá)譜的調(diào)節(jié)，促進(jìn)其向具有修復(fù)功能的M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變，從而發(fā)揮修復(fù)腎組織損傷的作用。與干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化和