間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子通過PKCepsilon對心肌缺血再灌注損傷的保護機制研究.pdf

1、背景:
　　現(xiàn)今血管再通技術(shù)的應(yīng)用顯著降低了心肌梗死患者的死亡率和致殘率。而再灌注所造成的損傷會導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡和壞死，進一步擴大心肌的梗死面積。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)被認(rèn)為是最有可能列入臨床常規(guī)細(xì)胞治療的細(xì)胞種類之一，它的旁分泌作用是其治療心血管疾病的重要機制。PKCε在缺血預(yù)處理保護缺血再灌注損傷中起重要作用，且PKCε已經(jīng)成為降低缺血再灌注損傷的重要靶點。
　　目的:<

2、br>　　在本研究中，我們試圖闡明應(yīng)用MSCs旁分泌因子(MSCs paracrinefactors，MPF)治療心肌缺血再灌注損傷的效果，及其的心肌保護作用機制，并且揭示PKCε在MPF保護效果中發(fā)揮作用。
　　方法:
　　1.我們用2mg/kg，5mg/kg和10mg/kg MPF與成纖維細(xì)胞分泌因子(fibroblastparacrine factors，F(xiàn)ibroPF)10mg/kg尾靜脈注射對比，并在24小時行Ev

3、ans藍/TTC染色，第二天進行TUNEL染色，第7天進行心超方法檢測心功能，確定MPF在小鼠心臟缺血再灌注損傷中的保護作用，及起效劑量。用western blot方法探究再灌注15分鐘后，MPF對于PKCε的磷酸化和轉(zhuǎn)位效應(yīng)。
　　2.用TUNEL和ROS檢測方法，在體外驗證MPF對于心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護作用，同時用PKCε轉(zhuǎn)位抑制劑εV1-2探究PKCε在MPF保護心肌細(xì)胞中發(fā)揮的作用。通過檢測線粒體ALDH2活性和4H

4、NE的水平來證實PKCε在MPF降低心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用。
　　3.運用PKCε顯性失活（PKCε dominant negative，PKCε-DN）的轉(zhuǎn)基因小鼠，探究PKCε在MPF減小心梗面積、改善心功能、減少心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的作用。通過檢測組織線粒體中4HNE水平探究MPF對于PKCε-DN小鼠的治療效果。
　　4.檢測MPF處理缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的NO水平和NOS磷酸化和表達水平，并運用NOS抑制劑L-NAME

5、和自由基清除劑ebselen，探究eNOS/NO通路在MPF介導(dǎo)的PKCε轉(zhuǎn)位中的作用，探究MPF促進PKCε轉(zhuǎn)位的作用機制。
　　結(jié)果:
　　1.5mg/kg MPF尾靜脈注射治療可以有效減小缺血再灌注損傷造成的心梗面積，改善心功能，減少心肌細(xì)胞的凋亡，并且促進心肌內(nèi)PKCε的磷酸化，促進PKCε從胞漿向線粒體轉(zhuǎn)位。
　　2.MPF可降低心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷后的凋亡和氧化應(yīng)激，提高ALDH2的活性，降低4HNE的水平

6、。并且εV1-2可以抑制MPF對于心肌細(xì)胞產(chǎn)生的這些保護效果。
　　3.在PKCε-DN的小鼠中，MPF對于心肌缺血再灌注損傷的保護作用有所降低。心梗面積變大，心功能無明顯改善，心肌細(xì)胞凋亡增加。同時，MPF治療后，線粒體4HNE水平在PKCε-DN小鼠中比WT高。
　　4.MPF可以提高心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后的eNOS磷酸化水平以及NO產(chǎn)生，對nNOS和iNOS沒有明顯效果。且L-NAME和ebselen可以抑制MPF介導(dǎo)的P