骨髓間充質(zhì)干細胞對大鼠小腸缺血再灌注損傷的保護作用.pdf

1、目的：①建立腸缺血再灌注損傷的動物模型，了解大鼠小腸腸黏膜屏障功能受損后的病理改變。②分離、培養(yǎng)、純化大鼠骨髓源性間充質(zhì)干細胞，獲得足夠的間充質(zhì)干細胞，并對其表面分子進行檢測。③通過骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療腸屏障功能障礙的大鼠，評價其對大鼠腸屏障功能的保護作用。
　　 方法：⑴采用阻斷腸系膜前動脈的方法建立腸缺血再灌注損傷的模型：健康雄性SD大鼠，250g-350g，氯胺酮麻醉并固定大鼠，于腹前正中線開腹，分層剪開皮毛、腹肌。找

2、到腸系膜前動脈，以3cm血管夾夾閉45min后開放，恢復血供。在造模后24h處死大鼠，獲取小腸病理組織，依據(jù)Chiu'小腸組織損傷評價標準對小腸損傷情況進行評分。對照組大鼠僅作假手術。⑵采用全骨髓差異貼壁法培養(yǎng)獲得骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC5)：無菌條件下取大鼠雙側(cè)下肢股骨和脛骨，剪開骨端，DMEM反復沖洗骨髓腔至骨干發(fā)白，將沖洗下的細胞懸液1000rpm離心5min，棄去上清液，用含10％～15％胎牛血清培養(yǎng)液重懸后，接種于75cm2培

3、養(yǎng)瓶，在37C，5％CO2，飽和濕度CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天觀察細胞生長、貼壁情況。細胞生長至培養(yǎng)瓶面積約90％時傳代，根據(jù)細胞生長情況1∶2或1∶3傳代。傳至第3代時，胰酶消化，收獲細胞，流式細胞儀檢測。將收獲的MSCs分入7個EP管，每管約1×106個細胞，分別為CD29及其同型對照管、CD34及其同型對照管、CD45和CD90及其同型對照管，各管內(nèi)加入相應標記抗體，避光孵育40min后上機檢測。⑶獲取雄性SD大鼠的MSCs，傳代、

4、增殖、純化。制作大鼠腸I/R模型。將第3代MSCs用4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)標記，熒光顯微鏡觀察標記率。再將MSCs制成細胞懸液，濃度為1×106/ml，于造模成功后60min，通過尾靜脈注射到大鼠體內(nèi)，1ml/只。對照組尾靜脈注射等量生理鹽水。于輸注后6h、24h、72h分批處死大鼠，獲取血液、小腸組織等標本。檢測血液IL-6、IL-10、TNF-α、MDA、SOD的濃度。小腸組織部分行快速冰凍，熒光顯微鏡下觀察DAPI

5、陽性細胞：部分常規(guī)HE染色，觀察腸黏膜受損情況；部分作免疫組化，觀察腸上皮細胞壞死和增殖修復情況。
　　 結(jié)果：①夾閉腸系膜前動脈后，腸系膜動脈搏動消失，腸管變白、痙攣、皺縮，約在40min后腸管鼓脹、呈暗紅色，恢復腸系膜前動脈血供后，腸系膜動脈恢復搏動，腸管恢復蠕動，顏色變?yōu)轷r紅色。小腸組織常規(guī)病理鏡下觀察多數(shù)標本腸黏膜破損、潰瘍、出血，固有層破壞、毛細血管暴露，中性粒細胞大量浸潤，局部出血，甚至有固有層腺體的破壞，腸絨毛萎縮

6、，少數(shù)標本病理損傷較輕。Chiu'小腸組織損傷評價標準評分為54.83±4.26分。②倒置相差顯微鏡觀察原代接種24h即可見較多細胞貼壁，外觀呈紡錘形和多角形，72h后細胞數(shù)量開始增多，細胞形態(tài)呈成纖維細胞樣長梭形，培養(yǎng)至9d左右細胞匯合達到90％左右，細胞呈極性排列，集落呈漩渦狀。經(jīng)過換液和傳代后，細胞逐漸純化，至第3代時，細胞形態(tài)均一，呈膜狀鋪展。細胞表面標記物經(jīng)流式細胞儀檢測，CD29陽性率為98.6％、CD90陽性率99.6％；

7、而CD34、CD45為陰性，陽性率分別為0.56％、0.89％。③MSCs輸注治療組大鼠的血清IL-6、TNF-α水平在治療后6h和24h顯著低于對照組(P＜0.05)；血清IL-10則顯著高于對照組(P＜0.05)； MDA水平在各時間點組間都有顯著性差異(P＜0.05)，SOD在治療后24h組間有顯著性差異(P＜0.01)。治療組小腸組織熒光顯微鏡下觀察可見DAPI陽性細胞。病理及免疫組化顯示，治療組腸黏膜損傷在6h、24h較對照組

8、輕，24h和72h治療組腸黏膜組織細胞增殖較對照組明顯(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：⑴夾閉腸系膜前動脈建立腸I/R模型，可以引起小腸黏膜的壞死、潰瘍、出血；模型穩(wěn)定，適合作為研究對象。⑵全骨髓差異貼壁法能夠獲得較高純度的MSCs，獲得的第3代MSCs純度達到95％以上，流式細胞儀鑒定結(jié)果為：CD29陽性率98.6％，CD90陽性率99.6％，CD34、CD45為陰性，陽性率分別為0.89％、0.56％，為后續(xù)實驗提供了充足的M