B7-H1在間充質干細胞保護腸缺血再灌注損傷中的作用.pdf

1、目的:1.探討小鼠脂肪間充質干細胞(adipose-derived stem cells ADSCs)的體外分離、培養(yǎng)、純化方法及其表型的鑒定，從而為間充質干細胞的來源提供更加廣闊的選擇。2.小鼠腸缺血再灌注損傷動物模型的建立和評估。3.探討B(tài)7-H1/PD-1信號通路在脂肪間充質干細胞保護腸缺血再灌注損傷中發(fā)揮的作用。
　　方法:1.取5～6周齡，體重約20 g的健康、雄性C57BL/6小鼠，采用貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)、純化其AD

2、SCs，觀察原代及傳代細胞的形態(tài)結構及生長狀況，并用流式細胞儀鑒定其第3代細胞的表型。2.建立C57 BL/6小鼠腸缺血再灌注損傷模型:取6周齡，體重約20g的健康、雄性C57 BL/6小鼠，術前可自由飲水，禁食12小時，手術在嚴格無菌條件下進行，使用無損動脈夾夾閉小鼠腸系膜前動脈的起始部，30min后松開血管夾，逐層關腹，以建立腸缺血再灌注損傷模型，建模成功后24小時處死小鼠觀察小腸組織的損傷情況。3.取第三代脂肪間充質干細胞制成單細

3、胞懸液，濃度為1×106/ml，將動物分為三組:B7H1+組、B7H1組、對照組，三組依次建立腸缺血再灌注損傷動物模型，B7-H1+組經靜脈注入體積為1ml的單細胞懸液，B7-H1-組經靜脈注入等體積的細胞懸液（抗B7-H1單克隆抗體處理），對照組僅注入等體積的生理鹽水，分別于術后6小時、24小時、72小時處死小鼠，獲取小腸組織和動物血清留以備用，用4，6-聯脒-2-苯基吲哚(DAPI)標記脂肪間充質干細胞，觀察ADSCs在小腸的定植情

4、況，小腸組織行常規(guī)HE染色觀察腸道黏膜，酶聯免疫吸附劑測定(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)方法測定不同處理組別之間細胞因子的水平，以探討共刺激分子B7-H1在腸缺血再灌注損傷中的保護作用。
　　結果:1.成功分離、培養(yǎng)、純化ADSCs，倒置相差顯微鏡觀察原代接種24小時后可見較多細胞貼壁，72小時后細胞數量逐漸增多，細胞形態(tài)多呈梭形生長，經過換液和多次傳代后，雜質細胞數量逐漸減少，ADS

5、Cs逐漸純化;細胞表面標記物經流式細胞儀檢測結果為CD90、CD29均為高表達;CD34、CD45為低表達。
　　2.實驗組小鼠夾閉腸系膜前動脈后發(fā)現腸系膜前動脈搏動消失，腸管逐漸變白、痙攣甚至皺縮?；謴脱苎┮院螅瑒用}逐漸恢復搏動，腸管逐漸恢復蠕動，顏色由灰白色變?yōu)轷r紅色。小腸組織常規(guī)病理鏡下觀察多數標本小腸黏膜破損嚴重、潰瘍和出血，固有層破壞嚴重，同時可見中性粒細胞大量浸潤伴有黏膜的局部出血，甚至存在固有層腺體的破壞，腸絨毛

6、嚴重萎縮。
　　3.DAPI標記的脂肪間充質干細胞可以定向遷移到受損的腸道，B7-H1+治療組大鼠的血清IL-2、TNF-α水平在治療后6h和24h顯著低于對照組和B7H1-組(P＜0.05);血清IL-10的水平則顯著高于對照組和B7H1-組(P＜0.05)，腸組織病理顯示B7H1+治療組的腸道修復更快。
　　結論:1.貼壁培養(yǎng)法可以成功分離、培養(yǎng)及純化ADSCs，且其細胞純度比較高，同時由于脂肪組織來源充分、易于獲取等優(yōu)