BDNF基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞移植對脊髓缺血再灌注損傷保護作用的研究.pdf

1、目的：
　　 脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。繼發(fā)性損傷是原發(fā)性損傷后出現(xiàn)的一系列病理改變,其發(fā)病機制極其復(fù)雜,脊髓中的神經(jīng)元再生非常有限,脊髓損傷常導(dǎo)致諸如截癱、四肢癱瘓等嚴重的功能障礙[1,2]。其中,缺血再灌注損傷是造成神經(jīng)損傷的一個重要因素。脊髓缺血再灌注損傷的具體機制尚不清楚,氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、鈣離子超載、興奮性氨基酸、前列腺素等因素在脊髓損傷機制中起重要的作

2、用己得到公認[3-5]。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù),使含神經(jīng)營養(yǎng)基因的細胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)素,促進神經(jīng)功能恢復(fù)成為近期研究的熱點[6,7]。
　　 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brainderivedneurophicfactor,BDNF)是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子,可改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)、促進受損傷神經(jīng)元再生、減少神經(jīng)元凋亡[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)干細胞移植能改變脊髓內(nèi)微環(huán)境,并使BDNF表達增多,但內(nèi)源性BDNF的表達不足以修復(fù)脊髓損傷。骨髓間

3、充質(zhì)干細胞(bonemesenchymalstemcells,BHSCs)的來源廣泛,易于獲取并在體外擴增,可以獲得足夠數(shù)量的細胞用于細胞治療[9-11]。不僅易于外源基因的轉(zhuǎn)染和表達,而且轉(zhuǎn)染外源基因并不影響B(tài)MSCs多向分化能力和體外增殖能力,因此,BMSCs可以作為一種新型的基因治療的靶細胞。由于所攜帶的外源基因可表達部分調(diào)控損傷部位微環(huán)境的神經(jīng)因子,從而促進BHSCs向神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞分化[12]。綠色熒光蛋白(Greenf

4、luorescentprotein,GFP)不影響細胞的活性或功能,已被廣泛用于監(jiān)測活組織及固定后組織的基因表達、蛋白定位及移植細胞的示蹤[13,14]。國內(nèi)外研究者成功構(gòu)建了BDNF-GFP質(zhì)粒并在BMSCs中表達,既能促進神經(jīng)元的生長,又能進行很好的示蹤,有很好的應(yīng)用前景[15-47]。
　　 本實驗擬構(gòu)建BDNF-GFP真核表達載體,并在BMSCs中表達,然后將BDNF-GFP轉(zhuǎn)染的BMSCs移植入大鼠脊髓缺血再灌注損傷模

5、型,檢測其對脊髓損傷的修復(fù)效果并探討可能的相關(guān)機制。
　　 方法：
　　 一、大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 1.應(yīng)用貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠BMSCs。
　　 2.繪制第三代BMSCs的生長曲線。
　　 3.應(yīng)用流式細胞儀檢測大鼠第3代BMSCs的表面標志物CD34、CD44、CD90。
　　 二、構(gòu)建BDNF-GFP真核表達載體,檢測BDNF在BMSCs中表達
　　 1.擴增

6、提純重組質(zhì)粒pEGFP-N1-BDNF。
　　 2.對構(gòu)建的pEGFP-N1-BDNF重組質(zhì)粒進行HindⅢ/KpnⅠ雙酶切鑒定。
　　 3.RT-PcR鑒定pEGFP-NI-BDNF轉(zhuǎn)染的BMSCs中BDNF的mRNA轉(zhuǎn)錄;應(yīng)用ELISA方法和Westernblotting檢測經(jīng)pEGFP-N1-BDNF轉(zhuǎn)染后BMSCs的BDNF表達情況。
　　 三、觀察BDNF-GFP轉(zhuǎn)染的BMSCs移植入大鼠脊髓缺血再灌注

7、損傷模型后對脊髓損傷后神經(jīng)功能修復(fù)情況
　　 1.建立大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型,實驗分組。
　　 2.后肢運動評分。
　　 3.各組大鼠術(shù)后1w脊髓HE染色。
　　 4.免疫組化檢測各組大鼠術(shù)后1w脊髓BDNF表達。
　　 5.免疫組化檢測各組大鼠不同時間點脊髓caspase-3免疫組化陽性細胞計數(shù)情況。
　　 結(jié)果：
　　 一、成功分離、培養(yǎng)并鑒定大鼠BMSCs
　　

8、1.原代和傳代培養(yǎng)大鼠BMSCs貼壁生長良好,形態(tài)為較一致的長梭形、紡錘形。10-14d時集落邊緣匯合,細胞呈較均一的旋渦狀或螺旋狀分布。
　　 2.體外分離培養(yǎng)的BMSCs能夠較好的擴增,與其他細胞相同,均經(jīng)歷了潛伏適應(yīng)期、對數(shù)生長期和生長平臺期。
　　 3.應(yīng)用流式細胞儀檢測大鼠第3代BMSCs的表面標志物CD34陰性,陽性率為0.97%;CD44陽性,陽性率為97.57%;CD90陽性,陽性率為98.98%。

9、>　　 二、成功構(gòu)建BDNF-GFP真核表達載體,BDNF在BMSCs中可以表達
　　 1.重組質(zhì)粒pEGFP-N1-BDNF擴增提純成功。
　　 2.對構(gòu)建的pEGFP-N1-BDNF重組質(zhì)粒進行HindⅢ/KpnⅠ雙酶切鑒定,電泳結(jié)果顯示長約4.7kb和775bp的兩個條帶,一條與pEGFP-N載體序列(約4.7kb)接近,另一條與BDNF目的基因序列(775bp)吻合。
　　 3.RT-PCR鑒定證實pE

10、GFP-N1-BDNF轉(zhuǎn)染的BMSCs中存在BDNF的mRNA轉(zhuǎn)錄;應(yīng)用ELISA方法和Westernblotting檢測經(jīng)pEGFP-N1-BDNF轉(zhuǎn)染后BMSCs的BDNF表達量明顯高于對照組。
　　 三、BDNF-GFP轉(zhuǎn)染的BMSCs移植入大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型,可明顯改善脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)
　　 1.成功建立大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型。
　　 2.(BDNF+BMSCs)組大鼠缺血再灌注后24h

11、出現(xiàn)后肢癱瘓癥狀,在72h和1w時,Tarlov評分顯著增高,癱瘓明顯改善,后肢不僅可支持體重,甚至可以蹣跚行走或行走接近正常,與模型組大鼠比較,差異有顯著性意義(p＜0.01)。
　　 3.移植BDNF+BMSCs組大鼠術(shù)后1w脊髓HE染色未見空泡形成,細胞核存在,核仁及尼氏體清晰可見,與模型組比較脊髓損傷明顯減輕。
　　 4.移植BDNF+BMSCs組大鼠術(shù)后1w脊髓細胞胞漿內(nèi)有較多棕色顆粒,與模型組和移植BMSCs

12、組比較BDNF表達量明顯增多。
　　 5.移植BDNF+BMSCs組大鼠缺血再灌注后24hcaspase-3免疫組化陽性細胞計數(shù)達最高峰,隨時間延長,陽性細胞計數(shù)逐漸下降;在同一個時間點,(BDNF+BMSCs)組大鼠caspase-3免疫組化陽性細胞計數(shù)與模型組和BMSCs移植組大鼠比較,均為最低,差異有顯著性意義(p＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.貼壁法體外培養(yǎng)大鼠BMSCs操作簡便,細胞增殖能力強,