骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源exosome對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的:探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow Mesenchymal stem cells，BM-MSC)來(lái)源exosome對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷(Ischemia Reperfusion Injury，IRI)的保護(hù)作用及機(jī)制。
　　方法:(1)采用貼壁細(xì)胞分離法分離培養(yǎng)大鼠MSC，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSC表面分子標(biāo)志CD44、CD29、CD34。加入成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液，觀察MSC向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞的分化能力，

2、鑒定其多向分化潛能。(2)采用TotalExosome Isolation Reagent結(jié)合超速離心法提取MSC及成纖維細(xì)胞(HFL-1)培養(yǎng)上清中的exosome。透射電鏡下觀察exosome的形態(tài)特點(diǎn)及粒徑大小，并使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)exosome表面分子標(biāo)志CD63表達(dá)情況。（3)選取雄性SD大鼠200～250g共30只，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組），缺血再灌注損傷組（IR組），MSC處理組（IR+MSC組），MSC來(lái)源exos

3、ome處理組（IR+MSC-ex組），成纖維細(xì)胞來(lái)源exosome處理組（IR+F-ex組）。構(gòu)建IR損傷模型，夾閉左側(cè)腎蒂45分鐘，開(kāi)放左腎動(dòng)脈時(shí)切除右腎，在IR損傷即刻經(jīng)頸動(dòng)脈注入MSC或exosome，IR組給予等量PBS，Sham組僅游離腎蒂后關(guān)腹。(4)術(shù)后48h處死大鼠，留取全血、腎組織福爾馬林固定標(biāo)本及腎組織液氮冰凍標(biāo)本。檢測(cè)血清肌酐和尿素氮水平，HE染色觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)改變并根據(jù)Paller標(biāo)準(zhǔn)行病理評(píng)分，TUNEL染

4、色評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡，腎臟冰凍標(biāo)本提取蛋白質(zhì)及RNA，PCR檢測(cè)炎癥因子IL-1β、TNF-α表達(dá)水平，Western印跡法檢測(cè)腎組織Caspase-3、Bcl-2、Bax、PI3K、P-Akt表達(dá)水平。
　　結(jié)果:(1) MSC生長(zhǎng)特征:大鼠骨髓MSC呈長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)。傳代后，細(xì)胞增殖明顯，高度融合，呈漩渦狀或輻射狀排列。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面高表達(dá)CD29、CD44，低表達(dá)CD34。經(jīng)成骨及成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)后，MSC成功分化為成骨細(xì)胞和

5、脂肪細(xì)胞。(2) Exosome特征:透射電鏡下觀察，提取物為微囊泡樣小體結(jié)構(gòu)，圓形或橢圓形，大小均一，直徑在30-60nm。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面標(biāo)志CD63表達(dá)陽(yáng)性，證實(shí)提取物為exosome。(3)對(duì)腎功能的作用:再灌注后48小時(shí)，MSC組、MSC-ex組血肌酐（分別為147.5±15.89，231.5±30.03）、尿素氮（分別為20.49±5.70，31.36±5.53）與IR組（482±36.87，45.42±2.73）相比均

6、顯著降低;MSC-ex組與F-ex組肌酐（442±41.98）、尿素氮（46.89±3.21）相比，腎功能也顯著改善，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(4)腎臟病理變化比較:HE染色切片觀察，MSC組、MSC-ex組與IR組相比，病理?yè)p傷明顯減輕，Paller評(píng)分（分別為22.50±6.28，35.17±7.57）與IR組（59.50±8.12）相比顯著降低（均P＜0.001）;MSC-ex組（35.17±7.57）與F-ex組（58.67±8.

7、59）相比也顯著降低(P＜0.01)。(5)凋亡比較:TUNEL染色檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，MSC組、MSC-ex組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（分別為5.17±1.17，8.67±1.63）與IR組（13.67±1.86）相比明顯減少(P＜O.001，P＜0.01);MSC-ex組（8.67±1.63）與F-ex組（12.67±1.75）相比也明顯減少(P＜0.01)。(6)炎癥因子變化:實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組炎癥因子IL-1β、TNF-α表達(dá)，再灌注

8、后48小時(shí)，IR組炎癥因子水平明顯升高，與IR組相比，MSC組與MSC-ex組的IL-1β表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)，而TNF-α表達(dá)水平則明顯降低(P＜0.01);與F-ex組相比，MSC-ex組IL-1β表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)，TNF-α表達(dá)明顯減少(P＜0.05)。(7)蛋白水平變化:Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)通路蛋白表達(dá)，與IR組、F-ex組相比，MSC與MSC-ex組Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)減少