骨髓間充質干細胞來源exosome對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用.pdf

1、目的:探討骨髓間充質干細胞(Bone marrow Mesenchymal stem cells，BM-MSC)來源exosome對大鼠腎缺血再灌注損傷(Ischemia Reperfusion Injury，IRI)的保護作用及機制。
　　方法:(1)采用貼壁細胞分離法分離培養(yǎng)大鼠MSC，使用流式細胞術檢測MSC表面分子標志CD44、CD29、CD34。加入成骨細胞、成脂細胞誘導培養(yǎng)液，觀察MSC向成骨細胞、脂肪細胞的分化能力，

2、鑒定其多向分化潛能。(2)采用TotalExosome Isolation Reagent結合超速離心法提取MSC及成纖維細胞(HFL-1)培養(yǎng)上清中的exosome。透射電鏡下觀察exosome的形態(tài)特點及粒徑大小，并使用流式細胞術檢測exosome表面分子標志CD63表達情況。（3)選取雄性SD大鼠200～250g共30只，隨機分為假手術組（Sham組），缺血再灌注損傷組（IR組），MSC處理組（IR+MSC組），MSC來源exos

3、ome處理組（IR+MSC-ex組），成纖維細胞來源exosome處理組（IR+F-ex組）。構建IR損傷模型，夾閉左側腎蒂45分鐘，開放左腎動脈時切除右腎，在IR損傷即刻經頸動脈注入MSC或exosome，IR組給予等量PBS，Sham組僅游離腎蒂后關腹。(4)術后48h處死大鼠，留取全血、腎組織福爾馬林固定標本及腎組織液氮冰凍標本。檢測血清肌酐和尿素氮水平，HE染色觀察腎臟組織形態(tài)學改變并根據Paller標準行病理評分，TUNEL染

4、色評價細胞凋亡，腎臟冰凍標本提取蛋白質及RNA，PCR檢測炎癥因子IL-1β、TNF-α表達水平，Western印跡法檢測腎組織Caspase-3、Bcl-2、Bax、PI3K、P-Akt表達水平。
　　結果:(1) MSC生長特征:大鼠骨髓MSC呈長梭形貼壁生長。傳代后，細胞增殖明顯，高度融合，呈漩渦狀或輻射狀排列。流式細胞術檢測其表面高表達CD29、CD44，低表達CD34。經成骨及成脂誘導液培養(yǎng)后，MSC成功分化為成骨細胞和

5、脂肪細胞。(2) Exosome特征:透射電鏡下觀察，提取物為微囊泡樣小體結構，圓形或橢圓形，大小均一，直徑在30-60nm。流式細胞術檢測其表面標志CD63表達陽性，證實提取物為exosome。(3)對腎功能的作用:再灌注后48小時，MSC組、MSC-ex組血肌酐（分別為147.5±15.89，231.5±30.03）、尿素氮（分別為20.49±5.70，31.36±5.53）與IR組（482±36.87，45.42±2.73）相比均

6、顯著降低;MSC-ex組與F-ex組肌酐（442±41.98）、尿素氮（46.89±3.21）相比，腎功能也顯著改善，差異均具有統(tǒng)計學意義。(4)腎臟病理變化比較:HE染色切片觀察，MSC組、MSC-ex組與IR組相比，病理損傷明顯減輕，Paller評分（分別為22.50±6.28，35.17±7.57）與IR組（59.50±8.12）相比顯著降低（均P＜0.001）;MSC-ex組（35.17±7.57）與F-ex組（58.67±8.

7、59）相比也顯著降低(P＜0.01)。(5)凋亡比較:TUNEL染色檢測腎小管上皮細胞凋亡，MSC組、MSC-ex組陽性細胞數（分別為5.17±1.17，8.67±1.63）與IR組（13.67±1.86）相比明顯減少(P＜O.001，P＜0.01);MSC-ex組（8.67±1.63）與F-ex組（12.67±1.75）相比也明顯減少(P＜0.01)。(6)炎癥因子變化:實時定量PCR檢測各組炎癥因子IL-1β、TNF-α表達，再灌注

8、后48小時，IR組炎癥因子水平明顯升高，與IR組相比，MSC組與MSC-ex組的IL-1β表達無明顯差異(P＞0.05)，而TNF-α表達水平則明顯降低(P＜0.01);與F-ex組相比，MSC-ex組IL-1β表達無明顯差異(P＞0.05)，TNF-α表達明顯減少(P＜0.05)。(7)蛋白水平變化:Western blot檢測凋亡相關通路蛋白表達，與IR組、F-ex組相比，MSC與MSC-ex組Caspase-3、Bax蛋白表達減少