一氧化碳通過促進β-catenin抑制巨噬細胞活化減輕腎缺血再灌注損傷.pdf

1、背景與目的:
　　腎缺血再灌注損傷(Renal ischemia reperfusion injury, renal IR)是臨床上急性腎功能衰竭主要病因，常導致腎臟不可逆損傷。隨著腎外傷及腎移植患者增多，防治缺血再灌注損傷已成為急需解決的難題。大量炎癥細胞浸潤至腎臟后激活釋放出白細胞趨化因子及炎癥因子造成腎臟細胞壞死、凋亡是腎缺血再灌注損傷過程發(fā)生發(fā)展的重要因素。一氧化碳(carbon monoxide，CO)具有抗血栓和擴張血

2、管的生物學效應，同時能夠抑制炎癥細胞活化及炎癥因子釋放，其是否對腎IR具有保護作用?本實驗旨在研究CO對小鼠腎IR損傷的保護作用及其分子機制。
　　方法:
　　第一部分:檢測外源性一氧化碳釋放分子(CORM-2)對小鼠腎IR的保護作用。將小鼠隨機均分為4組:假手術(shù)組（Sham組）、IR組、IR+CORM-2組和IR+iCORM-2組，檢測小鼠動脈COHb、O2Hb濃度及血清肌酐及尿素氮水平;PAS染色觀察腎臟組織損傷;免疫組

3、化檢測腎臟MPO、F4/80的表達;TUNEL檢測細胞凋亡情況;ELISA及RT-PCR檢測腎組織的炎癥因子的分泌水平。
　　第二部分:體外檢測CORM-2對巨噬細胞的抑制作用，分離培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細胞分為4組:Cell組、LPS組、LPS+CORM-2組和LPS+iCORM-2組，MTT檢測巨噬細胞的活性;RT-PCR及ELISA檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平;Western blot檢測p65、Akt、

4、GSK-3β和β-catenin蛋白表達變化。
　　第三部分:檢測β-catenin對CORM-2抗炎作用的影響，培育特異性敲除巨噬細胞β-catenin基因小鼠，檢測敲除小鼠PM和BMDMβ-catenin基因表達水平;分別分離培養(yǎng)β-cateninloxp/loxp×Lyz2Cre-/-小鼠及β-cateninloxp/loxp×Lyz2Cre+/-小鼠腹腔巨噬細胞分為3組:Cell組、LPS組、LPS+CORM-2組，RT-

5、PCR及ELISA檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平;Western blot檢測p65和β-catenin蛋白表達變化。檢測CORM-2對特異性敲除巨噬細胞β-catenin基因小鼠腎IR的作用，將β-cateninloxp/loxp×Lyz2Cre-/-小鼠及β-cateninloxp/loxp×Lyz2Cre+/-小鼠分為3組:Sham組、IR組、IR+CORM-2組，檢測血清肌酐及尿素氮水平;PAS染色觀察腎

6、臟組織損傷;免疫組化檢測腎臟F4/80的表達;RT-PCR檢測腎組織的炎癥因子的表達水平。
　　結(jié)果:
　　第一部分:CORM-2降低小鼠腎IR后血清肌酐及尿素氨水平、減少腎小管細胞損傷、壞死及凋亡、減少腎臟組織炎癥細胞浸潤及炎癥因子表達水平;
　　第二部分:CORM-2減少LPS刺激巨噬細胞炎癥因子的表達、促進Akt、GSK-3β蛋白磷酸化及β-catenin表達，抑制p65磷酸化;
　　第三部分:RT-PCR

7、結(jié)果β-cateninloxp/loxp×Lyz2Cre+/-小鼠巨噬細胞β-catenin表達水平明顯降低，β-catenin敲除后巨噬細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平增加、p65磷酸化水平增加;CORM-2抑制炎癥因子表達、p65磷酸化水平減弱;β-catenin敲除后小鼠IR血清肌酐及尿素氨水平增加、腎小管細胞損傷加重、腎臟F4/80陽性細胞及炎癥因子表達增加，CORM-2對腎功能及腎臟組織細胞保護作用減弱、