骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)重癥急性胰腺炎后胰腺組織損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、急性胰腺炎是臨床上常見(jiàn)的急腹癥之一，其中10-20％可發(fā)展為重癥急性胰腺炎。該類(lèi)型是一種病情兇險(xiǎn)、并發(fā)癥多、預(yù)后差、死亡率高的嚴(yán)重疾病。目前，臨床上對(duì)SAP的治療缺乏特異有效的治療方法。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）參與了急性胰腺炎的發(fā)病過(guò)程，并能減輕病情，改善預(yù)后，提高生存率，但BMSCs對(duì)SAP的作用機(jī)制目前尚不完全清楚。本課題以SD大鼠SAP為動(dòng)物模型，給予S

2、AP雄性大鼠移植同種異體BMSCs，觀察輸注后大鼠胰腺的病理?yè)p傷修復(fù)情況，并初步探討B(tài)MSCs對(duì)SAP大鼠胰腺損傷的修復(fù)機(jī)制。
　　一、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取、分離、培養(yǎng)和鑒定
　　目的：體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行表面抗原鑒定及多向分化能力檢測(cè)，以建立穩(wěn)定的BMSCs體外培養(yǎng)、擴(kuò)增體系，供日后的實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　方法：取健康成年的雄性 SD大鼠，在無(wú)菌的條件下，取大鼠雙下肢，分離脛腓骨，與超凈臺(tái)

3、剪開(kāi)骨端，PBS徹底沖洗骨髓腔直至發(fā)白，1500rpm離心10分鐘，棄上清，大鼠淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll液）分離單個(gè)淋巴細(xì)胞，取單個(gè)淋巴細(xì)胞以DMEM-LG培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在24小時(shí)內(nèi)觀察細(xì)胞貼壁情況。首次傳代后繼續(xù)觀察生長(zhǎng)情況，繼而傳至第三代（P3）時(shí)，收取細(xì)胞并計(jì)數(shù)，進(jìn)行BMSCs的鑒定。
　　結(jié)果：在培養(yǎng)基中24后 BMSCs開(kāi)始貼壁，呈紡錘絲及三角等形態(tài)生長(zhǎng)聚集，并有集落樣生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)幾次傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞純化，至P3代時(shí)細(xì)

4、胞形態(tài)均一。表面抗原鑒定：BMSCs流式細(xì)胞儀檢測(cè)其抗原,高表達(dá)CD29、CD90、低表達(dá)CD45、CD34；誘導(dǎo)分化能力鑒定：BMSCs誘導(dǎo)分化為成骨和成脂細(xì)胞。
　　結(jié)論：采用Ficoll密度梯度離心和體外細(xì)胞貼壁分離培養(yǎng)法相結(jié)合建立穩(wěn)定的BMSCs原代和傳代培養(yǎng)方法。
　　二、大鼠重癥胰腺炎模型的建立
　　目的：制作SD大鼠SAP動(dòng)物模型，為研究胰腺損傷修復(fù)提供可靠的動(dòng)物模型。
　　方法：健康成年雄性SD大

5、鼠共60只，體重250-300g，隨機(jī)分為2組：對(duì)照組（N=25）；模型組（N=25）。對(duì)照組大鼠僅翻動(dòng)胰腺，模型組分為6H、12H、24H、48 H、72H5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只大鼠。余10只大鼠均制作SAP，觀察72H生存率。實(shí)驗(yàn)大鼠禁食12H，自由飲水。濃度為5%?；悄懰徕c，行膽胰管逆行注射。在制模后各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)血清淀粉酶，胰腺和肺 HE染色，并依據(jù)schmidt評(píng)分法評(píng)分。觀察兩組動(dòng)物72H存活率。
　　結(jié)果：血清淀粉

6、酶水平6H、12H、24H、48H、72H均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）,胰腺組織schmidt評(píng)分均明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。兩組死亡率分別為0和70%。模型組病檢可見(jiàn)6H：小葉間隙增寬，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。12H：胰腺細(xì)胞壞死。24H：胰腺組織大面積壞死，出血和炎性細(xì)胞明顯。48H：胰腺組織壞死，胰腺細(xì)胞壞死，腺泡結(jié)構(gòu)消失，大量炎性細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞）浸潤(rùn)；72H：大量腺細(xì)胞壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　結(jié)論：采用5%牛

7、磺膽酸鈉成功制作SD大鼠SAP模型。由于在24H時(shí)胰腺損傷最為嚴(yán)重，我們?cè)?4H時(shí)間點(diǎn)選擇BMSCs干預(yù)治療。
　　三、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)重癥急性胰腺炎后胰腺組織損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：明確同種異體BMSCs能否減輕SAP大鼠病情，能否對(duì)其胰腺損傷具有保護(hù)或修復(fù)作用。
　　方法：將制模成功的 SAP模型大鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組（N=5）；SAP+培養(yǎng)基組（N=5）：接受相應(yīng)體積的培養(yǎng)基。S AP+BMSCs組（

8、N=5）：輸注BMSC。干預(yù)后24H，提取血清測(cè)定 AMY、ALT、CR、LDH和TNF-α和INF-α；獲取胰腺組織用于 HE染色，病理評(píng)分和檢測(cè)IL-1、IL-6、 IL-10表達(dá)情況。另取培養(yǎng)基組和 BMSCs組各10只大鼠觀察72H存活情況。
　　結(jié)果：三組 AMY、ALT、CR、LDH兩兩比較，均有顯著差異；培養(yǎng)基組血清中TNF-α和INF-α與BMSCs組相比較，差異顯著；BMSCs移植組胰腺組織中 TNF-α和INF

9、-α表達(dá)低于培養(yǎng)基輸注組（P<0.05）。BMSCs移植組大鼠的72小時(shí)生存率明顯高于培養(yǎng)基組。
　　結(jié)論： BMSCs的移植可以減輕 SAP大鼠胰腺病理?yè)p傷，改善病情，提高生存率。
　　四、同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在重癥急性胰腺炎大鼠體內(nèi)的遷移
　　目的：利用Y染色體檢測(cè)，明確雄性大鼠BMSCs在雌性模型屬內(nèi)的遷移，并初步探討B(tài)MSCs減輕SAP病情的機(jī)制。
　　方法：對(duì)照組：正常雌性大鼠3只，輸注雄性BMSC

10、s，實(shí)驗(yàn)組：雌性24H制模后SAP大鼠3只，等體積BMSCs，輸注24H后提取胰腺、腎臟、肝臟、心臟和肺，檢測(cè)雄性Y染色體DNA。
　　結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組中提取組織中分布Sry，以胰腺組織陽(yáng)性更為明顯。
　　結(jié)論：證實(shí)移植的同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，能夠定植在受損的部位，發(fā)揮其抗炎和修復(fù)作用。
　　全文小結(jié)
　　采用Ficoll密度梯度離心和貼壁分離法相結(jié)合可以分離、陪養(yǎng)、擴(kuò)增出較均一具有較強(qiáng)增殖分化能力的BMSCs；