骨髓間充質(zhì)干細胞促進重癥急性胰腺炎后胰腺組織損傷修復(fù)的實驗研究.pdf

1、急性胰腺炎是臨床上常見的急腹癥之一，其中10-20％可發(fā)展為重癥急性胰腺炎。該類型是一種病情兇險、并發(fā)癥多、預(yù)后差、死亡率高的嚴重疾病。目前，臨床上對SAP的治療缺乏特異有效的治療方法。據(jù)相關(guān)文獻報導，骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）參與了急性胰腺炎的發(fā)病過程，并能減輕病情，改善預(yù)后，提高生存率，但BMSCs對SAP的作用機制目前尚不完全清楚。本課題以SD大鼠SAP為動物模型，給予S

2、AP雄性大鼠移植同種異體BMSCs，觀察輸注后大鼠胰腺的病理損傷修復(fù)情況，并初步探討B(tài)MSCs對SAP大鼠胰腺損傷的修復(fù)機制。
　　一、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的提取、分離、培養(yǎng)和鑒定
　　目的：體外分離、培養(yǎng)、擴增大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞并進行表面抗原鑒定及多向分化能力檢測，以建立穩(wěn)定的BMSCs體外培養(yǎng)、擴增體系，供日后的實驗做準備。
　　方法：取健康成年的雄性 SD大鼠，在無菌的條件下，取大鼠雙下肢，分離脛腓骨，與超凈臺

3、剪開骨端，PBS徹底沖洗骨髓腔直至發(fā)白，1500rpm離心10分鐘，棄上清，大鼠淋巴細胞分離液（Ficoll液）分離單個淋巴細胞，取單個淋巴細胞以DMEM-LG培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在24小時內(nèi)觀察細胞貼壁情況。首次傳代后繼續(xù)觀察生長情況，繼而傳至第三代（P3）時，收取細胞并計數(shù)，進行BMSCs的鑒定。
　　結(jié)果：在培養(yǎng)基中24后 BMSCs開始貼壁，呈紡錘絲及三角等形態(tài)生長聚集，并有集落樣生長。經(jīng)過幾次傳代培養(yǎng)后，細胞純化，至P3代時細

4、胞形態(tài)均一。表面抗原鑒定：BMSCs流式細胞儀檢測其抗原,高表達CD29、CD90、低表達CD45、CD34；誘導分化能力鑒定：BMSCs誘導分化為成骨和成脂細胞。
　　結(jié)論：采用Ficoll密度梯度離心和體外細胞貼壁分離培養(yǎng)法相結(jié)合建立穩(wěn)定的BMSCs原代和傳代培養(yǎng)方法。
　　二、大鼠重癥胰腺炎模型的建立
　　目的：制作SD大鼠SAP動物模型，為研究胰腺損傷修復(fù)提供可靠的動物模型。
　　方法：健康成年雄性SD大

5、鼠共60只，體重250-300g，隨機分為2組：對照組（N=25）；模型組（N=25）。對照組大鼠僅翻動胰腺，模型組分為6H、12H、24H、48 H、72H5個時間點，每個時間點5只大鼠。余10只大鼠均制作SAP，觀察72H生存率。實驗大鼠禁食12H，自由飲水。濃度為5%?；悄懰徕c，行膽胰管逆行注射。在制模后各時間點檢測血清淀粉酶，胰腺和肺 HE染色，并依據(jù)schmidt評分法評分。觀察兩組動物72H存活率。
　　結(jié)果：血清淀粉

6、酶水平6H、12H、24H、48H、72H均顯著高于對照組（P<0.05）,胰腺組織schmidt評分均明顯高于對照組（P<0.05）。兩組死亡率分別為0和70%。模型組病檢可見6H：小葉間隙增寬，炎性細胞浸潤。12H：胰腺細胞壞死。24H：胰腺組織大面積壞死，出血和炎性細胞明顯。48H：胰腺組織壞死，胰腺細胞壞死，腺泡結(jié)構(gòu)消失，大量炎性細胞（中性粒細胞、淋巴細胞）浸潤；72H：大量腺細胞壞死，炎性細胞浸潤。
　　結(jié)論：采用5%牛

7、磺膽酸鈉成功制作SD大鼠SAP模型。由于在24H時胰腺損傷最為嚴重，我們在24H時間點選擇BMSCs干預(yù)治療。
　　三、骨髓間充質(zhì)干細胞促進重癥急性胰腺炎后胰腺組織損傷修復(fù)的實驗研究
　　目的：明確同種異體BMSCs能否減輕SAP大鼠病情，能否對其胰腺損傷具有保護或修復(fù)作用。
　　方法：將制模成功的 SAP模型大鼠隨機分為3組：對照組（N=5）；SAP+培養(yǎng)基組（N=5）：接受相應(yīng)體積的培養(yǎng)基。S AP+BMSCs組（

8、N=5）：輸注BMSC。干預(yù)后24H，提取血清測定 AMY、ALT、CR、LDH和TNF-α和INF-α；獲取胰腺組織用于 HE染色，病理評分和檢測IL-1、IL-6、 IL-10表達情況。另取培養(yǎng)基組和 BMSCs組各10只大鼠觀察72H存活情況。
　　結(jié)果：三組 AMY、ALT、CR、LDH兩兩比較，均有顯著差異；培養(yǎng)基組血清中TNF-α和INF-α與BMSCs組相比較，差異顯著；BMSCs移植組胰腺組織中 TNF-α和INF

9、-α表達低于培養(yǎng)基輸注組（P<0.05）。BMSCs移植組大鼠的72小時生存率明顯高于培養(yǎng)基組。
　　結(jié)論： BMSCs的移植可以減輕 SAP大鼠胰腺病理損傷，改善病情，提高生存率。
　　四、同種異體骨髓間充質(zhì)干細胞在重癥急性胰腺炎大鼠體內(nèi)的遷移
　　目的：利用Y染色體檢測，明確雄性大鼠BMSCs在雌性模型屬內(nèi)的遷移，并初步探討B(tài)MSCs減輕SAP病情的機制。
　　方法：對照組：正常雌性大鼠3只，輸注雄性BMSC

10、s，實驗組：雌性24H制模后SAP大鼠3只，等體積BMSCs，輸注24H后提取胰腺、腎臟、肝臟、心臟和肺，檢測雄性Y染色體DNA。
　　結(jié)果：實驗組中提取組織中分布Sry，以胰腺組織陽性更為明顯。
　　結(jié)論：證實移植的同種異體骨髓間充質(zhì)干細胞，能夠定植在受損的部位，發(fā)揮其抗炎和修復(fù)作用。
　　全文小結(jié)
　　采用Ficoll密度梯度離心和貼壁分離法相結(jié)合可以分離、陪養(yǎng)、擴增出較均一具有較強增殖分化能力的BMSCs；