骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠胰腺腺泡的保護(hù)作用.pdf

1、目的：
　　1.建立重癥急性胰腺炎胰腺腺泡損傷的動(dòng)物模型。
　　2.建立一種分離、純化、擴(kuò)增，CM-Dil標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞方法。
　　3.通過(guò)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療胰腺腺泡損傷的大鼠，評(píng)價(jià)其對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠胰腺功能的保護(hù)作用。
　　方法：
　　1.膽胰管逆行注射?；悄懰徕c造成大鼠急性出血壞死型胰腺炎（AHNP）模型，將大鼠隨機(jī)分為2組，麻醉、開(kāi)腹，以24G靜脈套管針于對(duì)側(cè)腸壁刺入腸腔，循乳頭將軟套

2、管穿入主胰膽管約0.5cm。3％?；悄懰徕c溶液30 mg/kg以12 ml/h泵入。對(duì)照組作假手術(shù)。
　　2.差異貼壁法獲得MSCs：剪開(kāi)大鼠股骨和脛骨的骨端，用DMEM+F12不斷沖洗。加入Ficoll分離液離心后用培養(yǎng)液重懸、接種、培養(yǎng)。觀察細(xì)胞貼壁情況，待生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶面積80%-90%時(shí)1:3傳代。以后1:2傳代。
　　3.取第3代MSCs用羰花青熒光染料CM-DiI(Chlormethylbenzamido-1，1

3、dioctadecyl-3，3，3ˊ，3ˊ-tetramethylindocarbocyamine)標(biāo)記。于造模后30MIN尾靜脈注射，1×106/100 mg。對(duì)照組注射等量生理鹽水。分批處死大鼠，檢測(cè)血液和腹水的指標(biāo)。胰腺組織行快速冰凍、HE染色、電鏡觀察和RT-PCR。
　　結(jié)果：
　　1.造模組6小時(shí)起，血淀粉酶水平顯著升高，至12小時(shí)達(dá)到高峰，病理評(píng)分至12-24h達(dá)到頂點(diǎn)，12h胰腺的病理評(píng)分為5.01+1.3。

4、顯微鏡下觀察，造模后12h可見(jiàn)間質(zhì)水腫、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、散在腺泡細(xì)胞壞死，至24h可見(jiàn)大片壞死、腺泡結(jié)構(gòu)破壞、出血及脂肪壞死。
　　2.顯微鏡觀察原代接種48h后細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)1W細(xì)胞匯合達(dá)到90％左右。傳至第3代時(shí)，細(xì)胞形態(tài)單一,呈膜狀鋪展。流式檢測(cè)顯示，至P3代時(shí)，CD29+CD90+CD34-CD45-群達(dá)到95%以上,經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化茜素紅染色陽(yáng)性,經(jīng)成脂誘導(dǎo)油紅染色陽(yáng)性。對(duì)照組均為陰性。
　　3. MSCs組比SAP

5、組血清的淀粉酶有顯著下降并在12小時(shí)達(dá)到高峰，血清TNF-α水平在治療后12h、24h顯著低于SAP組（P<0.05）。胰腺冰凍觀察可見(jiàn)CM-DiI陽(yáng)性細(xì)胞,電鏡觀察，SAP組胰腺腺泡出現(xiàn)損傷改變。MSCs干預(yù)組損傷較輕。PCR測(cè)定顯示在干細(xì)胞治療組中的AQP1的量明顯高于SAP組。
　　結(jié)論：
　　1.牛磺膽酸鈉膽胰管逆行注射成功制作實(shí)驗(yàn)性SAP大鼠模型。
　　2.差異貼壁法能獲得高純度的MSCs，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了充