固有免疫分子NLRP3在腦缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制.pdf

1、近些年來，腦血管疾病在世界范圍內(nèi)已經(jīng)成為最主要的死亡原因之一，這其中，腦缺血性疾病所占比例超過80％。早期恢復(fù)腦血流再灌注是救治腦缺血患者最有效的手段。但是再灌注治療有其兩面性:一方面血管再通，可使缺血腦組織功能得以恢復(fù)，病情得到控制，但另一方面部分患者腦功能不僅沒能恢復(fù)，反而出現(xiàn)病情進(jìn)一步加重，此即缺血再灌注損傷。實驗證明，多種病理過程都可引起缺血再灌注損傷發(fā)生。研究再灌注損傷的機(jī)制，為治療腦缺血疾病治療及再灌注損傷的預(yù)防提供了重要理

2、論基礎(chǔ)。
　　固有免疫系統(tǒng)被視為機(jī)體的第一道防線。入侵機(jī)體的病原體表面含有病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，它們可以被含有模式識別受體(pattern recognition receptors，PRR)的固有免疫細(xì)胞識別，進(jìn)而啟動免疫應(yīng)答。NLRP3是胞漿內(nèi)模式識別受體NOD樣受體家族一員，當(dāng)細(xì)胞受到感染等刺激時，被激活NLRP3能夠通過結(jié)合蛋白ASC(a

3、poptosis-associated speck-like protein containing)招募pro-caspase-1，并形成NLRP3炎性體。在炎性體的作用下，pro-caspase-1被激活成為caspase-1，而后者進(jìn)一步將IL-18和IL-1β的前體裂解成為有重要生物活性的炎癥因子，可以參與多種炎癥反應(yīng)過程。近年來的研究表明，阿爾茨海默病、2型糖尿病、動脈粥樣硬化、炎性腸病等的發(fā)病與進(jìn)展都與NLRP3有密切關(guān)聯(lián)，但

4、是NLRP3在腦血管疾病中的作用尚不明確。本實驗擬通過構(gòu)建腦中動脈栓塞模型和細(xì)胞的OGD模型從體內(nèi)和體外兩方面來研究NLRP3在缺血再灌注損傷中的作用及可能的機(jī)制。
　　目的:
　　1、研究小鼠缺血再灌注損傷后NLRP3及其下游分子在腦內(nèi)的表達(dá)及其作用;
　　2、研究小膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞在NLRP3介導(dǎo)下加重缺血再灌注損傷的機(jī)制;
　　3、研究缺血再灌注損傷中NADPH氧化酶對NLRP3通路的調(diào)控作用。

5、>　　方法:
　　第一部分:小鼠缺血再灌注損傷后NLRP3及其下游分子在腦內(nèi)的表達(dá)及作用
　　1、野生型小鼠缺血再灌注模型建立及模型評價。
　　1.1、實驗小鼠隨機(jī)分組，建立腦中動脈栓塞模型。
　　1.2、通過神經(jīng)學(xué)評分、TTC染色評價模型是否建立成功。
　　2、腦缺血再灌注損傷后NLRP3在小鼠腦中表達(dá)的變化及分布通過實時定量PCR、Western Blot、組織免疫熒光染色檢測NLRP3在損傷后的表達(dá)變

6、化及腦內(nèi)分布。
　　3、通過RT-PCR來檢測腦內(nèi)四種主要細(xì)胞NLRP3mRNA的表達(dá)情況。
　　4、NLRP3基因敲除鼠經(jīng)缺血再灌注處理后腦損傷改變及機(jī)制。
　　4.1、NLRP3基因敲除鼠基因型鑒定、分組及模型制備。
　　4.2、通過小鼠腦MRI平掃反映小鼠腦損傷整體程度;通過HE染色、Nissl染色、TUNEL染色分析組織損傷和神經(jīng)元凋亡程度。
　　4.3、血管神經(jīng)單元形態(tài)和功能檢查。
　　4.

7、4、WesternBlot和ELISA分別檢測各組腦組織中Caspase-1和細(xì)胞因子的表達(dá)變化。
　　4.5、WesternBlot和明膠酶譜法分別檢測各組腦組織中MMP9的蛋白含量和活性。
　　第二部分:小膠質(zhì)細(xì)胞在NLRP3介導(dǎo)下加重缺血再灌注損傷的機(jī)制
　　1、糖氧剝奪(Oxygenand Glucose Deprivation，OGD)模型建立
　　本實驗選用小鼠來源的小膠質(zhì)細(xì)胞株BV2細(xì)胞作為研究對象

8、。將細(xì)胞隨機(jī)分組。Western Blot檢測OGD處理后BV2細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1、NOX2表達(dá)以及NADPH氧化酶活性變化。
　　2、對分別轉(zhuǎn)染shRNA-NLRP3和shRNA-NOX2的BV2細(xì)胞進(jìn)行OGD處理，隨后檢測NLRP3下游分子的變化。
　　2.1、BV2細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
　　2.2、對轉(zhuǎn)染shRNA-NLRP3的BV2細(xì)胞進(jìn)行OGD處理，隨后檢測細(xì)胞NLRP3下游分子的變化。
　　2

9、.3、對轉(zhuǎn)染shRNA-NOX2的BV2細(xì)胞進(jìn)行OGD處理，隨后檢測細(xì)胞NLRP3的蛋白變化。
　　2.4、BV2細(xì)胞被分別轉(zhuǎn)染shRNA-NLRP3和shRNA-NOX2并接受OGD處理，隨后通過ELISA檢測其細(xì)胞因子的變化。
　　3、神經(jīng)元與BV2細(xì)胞共培養(yǎng)實驗。
　　BV2細(xì)胞在共培養(yǎng)上層皿孵育過夜。對分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和shRNA-NLRP3的BV2細(xì)胞進(jìn)行OGD處理。然后使之與下層皿中的神經(jīng)元共同培養(yǎng)。通過TU

10、NEL染色計數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率。
　　第三部分:內(nèi)皮細(xì)胞在NLRP3介導(dǎo)下加重缺血再灌注損傷的機(jī)制
　　1、內(nèi)皮細(xì)胞OGD模型建立
　　本實驗選用小鼠來源的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株bEND.3細(xì)胞作為研究對象。將細(xì)胞隨機(jī)分組。WesternBlot檢測OGD處理后bEND.3細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1、MMP2/9、ZO-1、TJP-2表達(dá)及Caspase-1活性變化。
　　2、對轉(zhuǎn)染shRNA-NLRP3的

11、bEND.3細(xì)胞進(jìn)行OGD處理，隨后檢測相關(guān)分子的變化
　　2.1、脂質(zhì)體介導(dǎo)的bEND.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
　　2.2、bEND.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA-NLRP3并接受OGD處理后，通過WesternBlot檢測其MMP2/9、ZO-1、TJP-2的蛋白表達(dá)變化。
　　2.3、ELISA檢測OGD處理后上述各組細(xì)胞培養(yǎng)基中細(xì)胞因子的表達(dá)變化。
　　3、體外內(nèi)皮細(xì)胞通透性實驗
　　內(nèi)皮細(xì)胞接種到膠原包被的小室內(nèi)，

12、孵育細(xì)胞48小時直至形成單層細(xì)胞。OGD處理后，通過測量穿過膠原層的dextran含量來反映腦內(nèi)皮細(xì)胞通透能力。
　　4、IL-1β對內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響
　　為驗證IL-1β對內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響，我們使用含有不同濃度IL-1β的培養(yǎng)基培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，并檢測內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變及相關(guān)分子表達(dá)。
　　第四部分:缺血再灌注損傷中NADPH氧化酶對NLRP3通路的調(diào)控作用
　　1、野生型小鼠腦缺血再灌注后NOX2表達(dá)及活

13、性變化
　　2、腦缺血再灌注后野生型及NOX2-/-小鼠腦損傷形態(tài)學(xué)比較
　　通過小鼠腦MRI平掃反映小鼠腦損傷整體程度。水腫面積分析及神經(jīng)學(xué)評分進(jìn)一步證實。
　　3、Western Blot檢測NOX2-/-小鼠損傷后NLRP3表達(dá)變化
　　4、數(shù)據(jù)處理
　　結(jié)果:
　　第一部分:小鼠缺血再灌注損傷后NLRP3及其下游分子在腦內(nèi)的表達(dá)及作用
　　1、野生型小鼠缺血再灌注模型建立及模型評價

14、>　　每組平均有15％小鼠因為死亡或是神經(jīng)學(xué)評分小于3分而被剔除。
　　2、腦缺血再灌注損傷后NLRP3在小鼠腦中表達(dá)的變化及分布
　　通過實時定量PCR和WesternBlot分析，我們發(fā)現(xiàn)NLRP3在損傷后表達(dá)有顯著的升高，并且在24小時達(dá)到高峰。通過免疫熒光染色得出，NLRP3主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。另外損傷后Caspase-1和細(xì)胞因子IL-1β、IL-18表達(dá)也呈升高趨勢。
　　3、通過RT-PC

15、R來檢測腦內(nèi)四種主要細(xì)胞NLRP3mRNA的表達(dá)情況
　　通過RT-PCR分析，NLRP3的mRNA主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞
　　4、NLRP3基因敲除鼠經(jīng)缺血再灌注處理后腦損傷改變及機(jī)制
　　通過MRI平掃我們發(fā)現(xiàn)NLRP3缺失后，再灌注腦損傷的面積明顯縮小，同時腦水腫程度也有所減輕。HE染色，Nissl染色和TUNEL染色從組織學(xué)和神經(jīng)元凋亡方面證明在敲除NLRP3后腦損傷減輕。我們采用依文思藍(lán)外滲試驗和

16、電鏡成像分別檢測再灌注損傷后血管神經(jīng)單元功能和形態(tài)的變化，并且我們發(fā)現(xiàn)盡管缺血再灌注后血管神經(jīng)單元的功能和形態(tài)都出現(xiàn)明顯損傷，但是NLRP3敲除鼠血腦屏障損傷較野生鼠輕，表現(xiàn)為依文思藍(lán)外滲量降低，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)良好，緊密連接較完整，血管周圍水腫不明顯。
　　通過進(jìn)一步分子水平檢測，我們發(fā)現(xiàn)腦損傷后Caspase-1、MMP9、細(xì)胞因子的高表達(dá)都可以因為NLRP3的敲除有明顯降低。
　　第二部分:小膠質(zhì)細(xì)胞在NLRP3介導(dǎo)下加重

17、缺血再灌注損傷的機(jī)制
　　1、糖氧剝奪(Oxygenand Glucose Deprivation，OGD)模型建立
　　建立OGD模型，通過WesternBlot分析，我們檢測到BV2細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1、NOX2表達(dá)在OGD后有顯著升高，Caspase-1、NOX2的活性也有升高趨勢。
　　2、對分別轉(zhuǎn)染shRNA-NLRP3和shRNA-NOX2的BV2細(xì)胞進(jìn)行OGD處理，隨后檢測NLRP3下游分

18、子的變化
　　2.1、Western Blot顯示，與對照組BV2細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)入shRNA-NLRP3或shRNA-NOX2的BV2細(xì)胞NLRP3或NOX2表達(dá)明顯降低，有顯著性差異。
　　2.2、ShRNA-NLRP3的轉(zhuǎn)染所引起的NLRP3表達(dá)下降可以削弱OGD所引起的Caspase-1表達(dá)及活性升高程度。
　　2.3、ShRNA-NOX2的轉(zhuǎn)染所引起的NOX2表達(dá)下降可以減弱OGD所引起的NLRP3表達(dá)升高程度。

19、
　　2.4、ELISA結(jié)果顯示，OGD處理后，BV2細(xì)胞的細(xì)胞因子(IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6)表達(dá)明顯升高，然而，我們發(fā)現(xiàn)不管是抑制細(xì)胞的NLRP3還是NOX2的表達(dá)，OGD處理后的BV2細(xì)胞因子含量都較Scramble處理組和正常細(xì)胞處理組有顯著地降低。
　　3、神經(jīng)元與BV2細(xì)胞共培養(yǎng)實驗
　　通過建立Transwell共培養(yǎng)模型，我們得出在OGD過程中，BV2細(xì)胞對神經(jīng)元有毒性作用。通過轉(zhuǎn)染

20、分別抑制BV2細(xì)胞NLRP3或NOX2的表達(dá)，再次與神經(jīng)元共培養(yǎng)，結(jié)果顯示BV2細(xì)胞對神經(jīng)元的毒性作用有所減弱。
　　第三部分:內(nèi)皮細(xì)胞在NLRP3介導(dǎo)下加重缺血再灌注損傷的機(jī)制
　　1、OGD模型建立
　　建立不同時間點的OGD處理模型，通過WesternBlot分析，我們檢測到bEND.3細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1、MMP2/9表達(dá)在OGD后有顯著升高，而ZO-1、TJP-2則出現(xiàn)降低趨勢。
　　2

21、、對轉(zhuǎn)染shRNA-NLRP3的bEND.3細(xì)胞進(jìn)行OGD處理，隨后檢測相關(guān)分子的變化
　　通過轉(zhuǎn)染shRNA-NLRP3抑制bEND.3細(xì)胞NLRP3的表達(dá)，并對細(xì)胞進(jìn)行OGD處理，我們檢測到細(xì)胞MMP2/9和相關(guān)細(xì)胞因子的升高程度被抑制，而ZO-1、TJP-2的降低趨勢也較對照組有所緩和。
　　3、體外內(nèi)皮細(xì)胞通透性實驗
　　通過體外內(nèi)皮細(xì)胞通透性實驗我們發(fā)現(xiàn)，OGD處理后內(nèi)皮細(xì)胞通透能力顯著增高，但是抑制內(nèi)皮細(xì)胞

22、NLRP3表達(dá)后，內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高水平有所降低。
　　4、IL-1β對內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響
　　經(jīng)過IL-1β處理后，內(nèi)皮細(xì)胞通透性升高，MMP2/9表達(dá)增高，ZO-1、TJP-2含量降低。
　　第四部分:缺血再灌注損傷中NADPH氧化酶對NLRP3通路的調(diào)控作用
　　建立缺血再灌注模型，通過MRI平掃，我們發(fā)現(xiàn)NOX2缺失后，再灌注腦損傷的面積明顯縮小，同時腦水腫程度也有所減輕。通過WesternBlot分析

23、得出，缺血再灌注損傷過程中NOX2缺乏可以使NLRP3表達(dá)下降，進(jìn)而影響到整個NLRP3通路。
　　結(jié)論:
　　1、體內(nèi)實驗證明，NLRP3的缺乏可以使腦梗死損傷程度減輕，血腦屏障功能得到保護(hù)，進(jìn)而減輕缺血再灌注后的小鼠腦損傷程度。
　　2、我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注損傷過程中，NLRP3引起的腦損傷與其介導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子通過自分泌和旁分泌模式作用于血管神經(jīng)單元有關(guān)。體外實驗中，NLRP3炎性體介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)