容量性鈣內(nèi)流在腦缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景:缺血性腦卒中(Cerebral ischemia stroke),是神經(jīng)系統(tǒng)最為常見的急重癥之一,是指各種腦血管先天發(fā)育異常以及后天因素(高血壓、高脂血癥、糖尿病等)引起的腦血管管腔狹窄、閉塞或堵塞,從而導(dǎo)致局部或全腦腦血流灌注銳減或中斷而引發(fā)的一種疾病。缺血性腦卒中其發(fā)病率、致殘率及致死率均高,嚴(yán)重威脅我國人民健康及生活質(zhì)量。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展,缺血再灌注治療(包括急性溶栓、介入取栓或支架置入及血管搭橋等)在臨床得到廣泛應(yīng)用,也取得

2、較好的療效。然而,在獲得缺血再灌注治療益處的同時(shí),其也可引起明顯的腦缺血再灌注損傷,嚴(yán)重影響治療效果。研究發(fā)現(xiàn),多種致傷機(jī)制均參與其中,如鈣超載、興奮性毒性、氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等。已有大量研究旨在闡明腦缺血再灌注損傷的致傷機(jī)制及尋找其潛在的干預(yù)靶點(diǎn),然而,目前情形并不容樂觀。
  容量性鈣內(nèi)流(Capacity calcium entry,CCE)是細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)態(tài)平衡的重要調(diào)節(jié)機(jī)制,通過感應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣濃度,調(diào)控CCE復(fù)合體形成,介

3、導(dǎo)外鈣內(nèi)流,補(bǔ)充細(xì)胞內(nèi)及鈣庫內(nèi)鈣。CCE復(fù)合體主要由鈣濃度感應(yīng)分子——基質(zhì)相互作用分子(Stromal interaction molecule,STIM)、鈣釋放激活的鈣通道(Ca2+ release-activated Ca2+channels,CRACs)及相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白構(gòu)成。氧化應(yīng)激、鈣庫排空及細(xì)胞酸化等因素可激活CCE,形成CCE復(fù)合體,調(diào)控神經(jīng)元存活,參與急、慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展。如前所述,氧化應(yīng)激、鈣超載等均參與腦缺

4、血再灌注損傷,那么CCE是否在其中發(fā)揮作用,及其具體機(jī)制如何,目前尚不可知。
  目的:本研究旨在:(1)明確腦缺血再灌注損傷中,CCE主要構(gòu)成分子時(shí)空變化規(guī)律及其作用;(2)探討調(diào)控CCE所介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制;(3)尋找潛在的CCE內(nèi)源性調(diào)控分子,為腦缺血再灌注損傷治療提供新的思路或潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。
  方法:
  1、采用原代海馬神經(jīng)元氧糖剝奪再灌注(Oxygen-glucose deprivation&reper

5、fusion,OGD/Rep.)模型體外模擬腦缺血再灌注損傷;采用谷氨酸誘導(dǎo)的HT-22細(xì)胞系氧化應(yīng)激模型研究Homer1a與CCE間相互作用關(guān)系;
  2、采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)及蛋白免疫印跡(Western Blot,WB)檢測OGD/Rep.處理后CCE構(gòu)成分子、凋亡及自噬相關(guān)分子的mRNA及蛋白水平改變;
  3、采用乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)釋放量檢測評價(jià)神經(jīng)元損傷情況,采用原

6、位末端標(biāo)記(Terminal dUTP nick end labelling,TUNEL)方法檢測神經(jīng)元凋亡改變;
  4、采用轉(zhuǎn)染STIM1、STIM2及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等熒光蛋白標(biāo)記質(zhì)粒及免疫熒光染色技術(shù)可視化CCE構(gòu)成分子空間定位變化;
  5、采用慢病毒介導(dǎo)的短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)及CRISPR/Cas9技術(shù)調(diào)控神經(jīng)元STIM1、STIM2及Homer1a表達(dá)水平;
  6、采用轉(zhuǎn)

7、染LC3-GFP及mRFP-GFP-LC3熒光蛋白標(biāo)記質(zhì)??梢暬窠?jīng)元自噬及自噬流改變;
  7、采用CCE、鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶II(Calmodulin-Dependent Protein Kinase II,CaMKII)及自噬藥物抑制劑或激動(dòng)劑調(diào)控其活性;
  8、采用Fluo-4 AM、Fura-red AM及胞漿鈣熒光指示蛋白監(jiān)測CCE介導(dǎo)的鈣內(nèi)流及胞漿內(nèi)鈣水平改變;
  9、采用蛋白質(zhì)免疫共沉淀(Co-i

8、mmunoprecipitation,co-IP)技術(shù)檢測蛋白分子間相互作用。
  結(jié)果:
  第一部分研究發(fā)現(xiàn):OGD/Rep.處理后,CCE主要構(gòu)成分子,包括STIM1、STIM2、Orai1、Orai2及TRPC1 mRNA及蛋白水平均無明顯改變,然而,胞漿內(nèi)STIM1斑塊數(shù)明顯增加;抑制 CCE可明顯減輕 OGD/Rep.引起的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣超載;下調(diào)或敲除STIM1表達(dá)或應(yīng)用CCE藥物抑制劑均可明顯減輕OGD/Re

9、p.誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷,抑制其凋亡,促進(jìn)神經(jīng)元存活。本部分研究表明,CCE參與OGD/Rep.介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的致傷機(jī)制,抑制CCE可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
  第二部分研究發(fā)現(xiàn):OGD/Rep.處理后,神經(jīng)元自噬水平增加,但同時(shí)也存在一定程度的自噬降解受阻;藥物激動(dòng)劑激活自噬可減輕OGD/Rep.介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷;CCE抑制可發(fā)揮類似自噬激動(dòng)劑的作用,在激活神經(jīng)元自噬的同時(shí),并一定程度改善自噬降解受阻;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),OGD/Rep.

10、處理后,CaMKII磷酸化水平明顯增加,而抑制CaMKII活性可明顯下調(diào)雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)磷酸化水平,促進(jìn)自噬激活,減輕神經(jīng)元損傷;抑制CCE后,CaMKII及mTOR磷酸化水平均明顯下降,且CCE抑制及mTOR抑制所介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用并無明顯疊加效應(yīng)。本部分研究表明,抑制CCE可一方面通過抑制CaMKII-mTOR信號(hào),促進(jìn)自噬形成,同時(shí)另一方面也可改善自噬降解受阻,

11、發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
  第三部分研究旨在尋找CCE潛在的內(nèi)源性負(fù)性調(diào)控分子,為排除離子型谷氨酸受體的影響,特采用谷氨酸誘導(dǎo)的HT-22細(xì)胞系氧化應(yīng)激模型,研究發(fā)現(xiàn):氧化應(yīng)激損傷后,STIM1及Orai1蛋白水平無明顯改變,而STIM1胞漿內(nèi)斑塊數(shù)明顯增加,并逐漸向細(xì)胞膜靠近;下調(diào)或敲除STIM1表達(dá)或采用CCE藥物抑制劑均可減輕神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷;上調(diào)Homer1a表達(dá)則可明顯抑制CCE所介導(dǎo)的鈣內(nèi)流、氧化應(yīng)激所引起的晚期細(xì)胞內(nèi)鈣

12、超載及線粒體氧化應(yīng)激損傷,發(fā)揮類似CCE抑制所介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用;此外,co-IP發(fā)現(xiàn)STIM1、Homer1a及Orai1間存在明顯蛋白相互作用,上調(diào)Homer1a蛋白表達(dá)可明顯抑制谷氨酸引起的STIM1-Orai1復(fù)合體形成。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,抑制CCE可減輕神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷,而Homer1a可通過抑制STIM1-Orai1復(fù)合體形成負(fù)性調(diào)控CCE,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
  結(jié)論:本研究首先證實(shí),CCE參與腦缺血再灌注損傷的致

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