MMP-9在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分大鼠局灶性腦缺血后MMP-9、TIMP-1、LN和FN的表達(dá)及血腦屏障通透性的改變 目的：觀察基質(zhì)會(huì)屬蛋白酶-9(Metalloproteinase-9，MMP-9)、金屬蛋白酶組織抑制因子-1(Tissue Inhibitors ofMatrix Metalloproteinase-1，TIMP-1)、層粘連蛋白(laminin，LN)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)在大鼠局灶性腦缺血再灌注中的表達(dá)，及腦

2、水腫和血腦屏障通透性改變的規(guī)律。探討血管源性腦水腫的形成機(jī)制。 方法：將42只體重為250～350克健康雄性成年’Wistar大鼠，隨機(jī)分成假手術(shù)組(sham組)、腦缺血再灌注組(ischemia-reperfusion，I/R組)；采用改良的線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)2h再灌注6h、24h、48h、72h、7d模型。在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)通過(guò)免疫組織化學(xué)方法

3、研究缺血區(qū)MMP-9、TIMP-1、LN和FN的表達(dá)變化規(guī)律，干濕重法檢測(cè)腦含水量，伊文思蘭(Evans blue，EB)作為示蹤劑檢測(cè)血腦屏障通透性改變。 結(jié)果：Sham組和I/R組的非缺血區(qū)未見(jiàn)MMP-9的表達(dá)：而LN和FN正常表達(dá)，染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，血管數(shù)目較多。在I/R組，MMP-9在I/R6小時(shí)即有表達(dá)，再灌注24h明顯增多，48h達(dá)高峰，72h下降，7d時(shí)有微量的表達(dá)；TIMP-1在Sham組無(wú)表達(dá)，在I/R的非缺血區(qū)也

4、有弱陽(yáng)性表達(dá)，在缺血區(qū)6h亦有表達(dá)，24h達(dá)高峰，48h時(shí)開(kāi)始下降，7d時(shí)有微量表達(dá)。再灌注24h時(shí)LN和FN的表達(dá)下降，48h達(dá)高峰，7d時(shí)基本恢復(fù)正常。腦含水量的變化：再灌注6h時(shí)腦含水量即升高，再灌注24、48h時(shí)明顯升高，與Sham組比較差異有顯著性意義(P<0.01)。伊文思蘭在再灌注6h前就已經(jīng)出現(xiàn)，至再灌注24-72h最為嚴(yán)重，各再灌注時(shí)間點(diǎn)與Sham組比較，有顯著性差異(P<0.01)。 結(jié)論：MMP-9和TIM

5、P-1在缺血性腦損傷中的表達(dá)在缺血早期是增多的，隨后降低；LN和FN的表達(dá)表現(xiàn)為由早期的較正常、降低、再回升的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，表達(dá)規(guī)律均呈時(shí)間依耐性。MMP-9通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜中的LN和FN等，是參與BBB損傷的機(jī)制之一。 第二部分強(qiáng)力霉素、白黎蘆醇及其聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的影響 目的:探討白黎蘆醇、強(qiáng)力霉素及其聯(lián)合應(yīng)用的神經(jīng)保護(hù)作用。 方法:雄性成年Wistar大鼠174只，隨機(jī)分成5組

6、：sham組、對(duì)照組、白黎蘆醇組、強(qiáng)力霉素組和聯(lián)合用藥組。分別于造模前6日每同將強(qiáng)力霉素(100mg/片)配制成濃度為0.75﹪的藥液，按4ml/kg，2次/d，直接灌胃給藥；白黎蘆醇配制成2﹪的藥液，按50mg/kg，腹腔注射給藥，1次/日；聯(lián)合用藥組同時(shí)給予上述兩種藥物干預(yù)治療。假手術(shù)組大鼠則同時(shí)給予上述標(biāo)準(zhǔn)等量生理鹽水灌胃和/或腹腔注射。預(yù)處理6天后造模，造模成功并經(jīng)評(píng)分入組后繼續(xù)給予相同劑量灌胃和/或腹腔注射治療至腦缺血2h再灌

7、注后的6h、24h、48h、72h和7d分別處死大鼠取材，檢測(cè)比較各組大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分、腦梗死比、腦含水量、EB含量、免疫組化MMP-9、TIMP-1、LN和FN的表達(dá)變化和電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察。 結(jié)果:1) 神經(jīng)功能缺損評(píng)分：與對(duì)照組相比，藥物組(分別指白黎蘆醇組、強(qiáng)力霉素組和聯(lián)合用藥組，以下相同)在再灌注24、48h的評(píng)分有顯著性差異；72h1~I聯(lián)合用藥組有顯著性差異(P<0.05)。2)再灌注24h時(shí)腦梗死比變化，藥物組

8、的梗死比與對(duì)照組比較，有顯著性差異(P<0.01)。3)腦含水量：藥物組和對(duì)照組的腦含水量在再灌注24、48和72h時(shí)比較有顯著性差異。4)EB含量：藥物組與對(duì)照組相比，在缺血再灌注6h、24h、48h、72h、7d各時(shí)間點(diǎn)的差異有顯著性意義(P<0.01，P<0.05)。5)對(duì)MMP-9和TIMP-1表達(dá)的影響：藥物組MMP-9和TIMP-1表達(dá)的部位和變化規(guī)律與對(duì)照組相似，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在6h、24h、48h和72h各時(shí)間點(diǎn)顯著低于對(duì)照

9、組(P<0.01)。6)對(duì)LN表達(dá)的影響：與對(duì)照組相比，各藥物組在再灌注的6、24、48h時(shí)間的陽(yáng)性血管數(shù)的比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。7)對(duì)FN表達(dá)的影響：與對(duì)照組相比，各藥物組在再灌注的6、24、48、72h時(shí)間點(diǎn)的陽(yáng)性血管數(shù)的比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，P<0.05)。8)再灌注24h時(shí)電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察，與對(duì)照組相比，藥物組內(nèi)皮細(xì)胞的水腫程度、基底膜間隙的增大和神經(jīng)元的凋亡現(xiàn)象相對(duì)減輕。 結(jié)論: 1．白黎

10、蘆醇和強(qiáng)力霉素可以減輕血管源性腦水腫的形成、縮小腦梗死體積、改善神經(jīng)功能的缺失，具有腦保護(hù)作用。 2．白黎蘆醇和強(qiáng)力霉素通過(guò)抑制MMP-9的表達(dá)，從而使伴隨MMP-9病理性表達(dá)升高的TIMP-1也相應(yīng)減少。 3．白黎蘆醇和強(qiáng)力霉素通過(guò)抑制MMP-9的活性而減輕LN和FN的降解，維持血腦屏障的完整性是其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制之一。 4．白黎蘆醇和強(qiáng)力霉素聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可以顯著縮小腦梗死體積，二者在神經(jīng)保護(hù)方面可能具有協(xié)同作用