眼針對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用及凋亡機(jī)制研究.pdf

1、目的及背景：缺血性腦血管疾病治療的關(guān)鍵在于挽救缺血半暗區(qū)瀕臨死亡的神經(jīng)元和促進(jìn)損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。腦缺血再灌注損傷是指腦組織經(jīng)一定時(shí)間的缺血后恢復(fù)血流供應(yīng)，使缺血性損傷進(jìn)一步加重的病理現(xiàn)象。腦缺血損傷的機(jī)制十分復(fù)雜。腦缺血再灌注損傷缺血半暗區(qū)神經(jīng)元死亡的主要形式是細(xì)胞凋亡。眼針療法治療中風(fēng)療效肯定。積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，但作用機(jī)制研究尚不深入，本課題從抑制細(xì)胞凋亡及調(diào)控細(xì)胞凋亡死亡受體通路信號(hào)傳導(dǎo)探討眼針對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制

2、，揭示眼針治療缺血性中風(fēng)部分作用機(jī)制，更好為臨床治療中風(fēng)病提供科學(xué)依據(jù)。 方法：分組方法：將健康雄性SD大鼠240只隨機(jī)分為假手術(shù)組66只，模型組和眼針組各87只。每組又分成腦缺血再灌3h，24h，72h等時(shí)間點(diǎn)。 模型制作方法：參照Longa改良的線栓方法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。 試驗(yàn)方法：眼針組取穴：上焦區(qū)、下焦區(qū)、肝區(qū)、腎區(qū)。刺法：用35×25mm毫針在相應(yīng)眼穴區(qū)距眶內(nèi)緣2mm處，平刺，由該區(qū)始點(diǎn)向

3、該區(qū)終點(diǎn)方向，刺入0.3cm，行捻轉(zhuǎn)手法，留針30分鐘，留針15分鐘時(shí)行針一次，持續(xù)時(shí)間1分鐘。針刺時(shí)機(jī)：再灌注即刻對(duì)動(dòng)物神經(jīng)功能缺損評(píng)分，隨機(jī)分到模型組與眼針組，眼針組各時(shí)間點(diǎn)在缺血再灌注即刻及處死動(dòng)物前針刺，動(dòng)物存活期間每12小時(shí)針刺一次。假手術(shù)組及模型組不做任何處理，常規(guī)喂養(yǎng)。 檢測(cè)方法及指標(biāo)：參照Longa.5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)神經(jīng)功能缺損癥狀評(píng)分；采用TTC染色測(cè)量梗死體積：光鏡及電鏡觀察缺血半暗帶腦組織病理改變及超微結(jié)

4、構(gòu)；應(yīng)用TUNEL法觀察缺血半暗區(qū)腦組織神經(jīng)元凋亡；采用免疫組化法檢測(cè)缺血半暗區(qū)腦組織Fax，F(xiàn)axl表達(dá)；采用RT-PCR法檢測(cè)缺血半暗區(qū)腦組織caspase-3，caspase-8mRNA蛋白表達(dá)；采用Elisa方法檢測(cè)缺血半暗區(qū)腦組織及血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量。 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法：所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值土標(biāo)準(zhǔn)差(x土s)表示。所得數(shù)據(jù)用SPSS10.0軟件進(jìn)行分析，組間比較采用單因素方差分析。 結(jié)果:

5、 1.眼針對(duì)神經(jīng)功能缺損癥狀評(píng)分的影響假手術(shù)組大鼠手術(shù)完成后，無神經(jīng)缺損體征出現(xiàn)。眼針組、模型組再灌注3h出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺損。3h時(shí)間點(diǎn)，眼針組與模型組兩組間比較無顯著差異；24h、72h時(shí)間點(diǎn)眼針組與模型組兩組間比較有極顯著差異。 2、眼針對(duì)腦梗死體積的影響再灌注24h，假手術(shù)組未發(fā)現(xiàn)有梗死病灶，模型組和眼針組梗死病灶主要位于右側(cè)額、顳、項(xiàng)葉皮質(zhì)及尾狀核、殼核區(qū)域。眼針組梗死體積顯著小于模型組。 3、眼針對(duì)缺血半暗帶

6、區(qū)神經(jīng)元病理改變及超微結(jié)構(gòu)的影響眼針治療組與模型組比較，腦組織形態(tài)有明顯改善。腫脹神經(jīng)元少見，細(xì)胞邊界清晰，核仁明顯。 電鏡觀察：眼針組半暗區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞可見較多線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體；與模型組比較明顯改善，與假手術(shù)組比較有輕微改變。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞較假手術(shù)組比較可見少量高爾基體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、核糖體，膠質(zhì)細(xì)胞基本正常。毛細(xì)血管內(nèi)皮光滑，基本正常。 4、眼針對(duì)缺血半暗區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響模型組及眼針組凋亡細(xì)胞于腦缺

7、血再灌注后3h開始增多，模型組、眼針組各時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞與假手術(shù)組相比均有顯著性差異;眼針組與模型組比較，3h時(shí)間點(diǎn)，無顯著性差異，24h、72h時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，有顯著性差異。 5、眼針對(duì)缺血半暗區(qū)神經(jīng)元FaxFaxl表達(dá)的影響免疫組化染色顯示：模型組、眼針組陽(yáng)性目標(biāo)表達(dá)均于腦缺血再灌注后3h開始增加，各時(shí)間點(diǎn)模型組、眼針組與假手術(shù)組比較陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均有顯著性差異；眼針組與模型組比較，3h時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性目標(biāo)表達(dá)無顯著性差異；

8、24h、72h時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性目標(biāo)表達(dá)顯著減少，有顯著性差異。 6、眼針對(duì)缺血半暗帶區(qū)Caspase-3，Caspase-8mRNA表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果顯示各時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組Caspase-3，Caspase-8mRNA僅見微弱表達(dá)；各時(shí)間點(diǎn)模型組、眼針組與假手術(shù)組比較Caspase-3，Caspase-8mRNA表達(dá)有顯著差異；眼針組與模型組比較，3小時(shí)無顯著性差異；24小時(shí)、72小時(shí)有非常顯著性差異。 7、眼針對(duì)缺血半

9、暗區(qū)腦組織及血液腫瘤壞死因子(TNF-α)含量的影響缺血半暗帶區(qū)皮層腦組織中FNF-α含量，各時(shí)間點(diǎn)模型組、眼針組與假手術(shù)組比含量有非常顯著性差異。3小時(shí)時(shí)間點(diǎn)眼針組與模型組比較，無顯著性差異；24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)有非常顯著性差異；72小時(shí)有顯著性差異。血液中TNF-α含量與腦組織中的含量趨勢(shì)基本相同。 結(jié)論: 1.改良線拴法制作腦缺血再灌注大鼠模型組出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀及腦梗死病灶，證明模型成功。 2.中風(fēng)病的病位在

10、腦，與肝腎關(guān)系密切;眼針可改善腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損.提示眼針可醒腦開竅，調(diào)臟腑虛實(shí)、通經(jīng)絡(luò)阻滯，因此提出：“眼絡(luò)于腦，通調(diào)臟腑”假說。 3.眼針可降低腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀評(píng)分，縮小腦梗死體積，改善缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元受損程度。 4.腦缺血再灌注大鼠模型缺血半暗區(qū)細(xì)胞凋亡嚴(yán)重，眼針可抑制缺血半暗帶區(qū)細(xì)胞凋亡。 5.腦缺血再灌注大鼠模型缺血半暗區(qū)Fax，F(xiàn)axl表達(dá)明顯增高；眼針可下調(diào)缺血半暗帶區(qū)F

11、ax，F(xiàn)axl表達(dá)。 6.腦缺血再灌注大鼠模型缺血半暗區(qū)Caspase-3，Caspase-8mRNA表達(dá)明顯增高；眼針可下調(diào)缺血半暗帶區(qū)Caspase-3，Caspase-8mRNA表達(dá)。 7.腦缺血再灌注大鼠模型缺血半暗區(qū)腦組織及血液中腫瘤壞死因子(TNF-α)含量明顯升高，眼針可使其表達(dá)下調(diào)。 8.本課題揭示了眼針治療缺血性腦血管病可能是通過抑制凋亡信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制細(xì)胞凋亡，挽救缺血半暗區(qū)，從而對(duì)腦缺血再