胰腺缺血再灌注誘導(dǎo)大鼠肺損傷的機(jī)理研究.pdf

1、在休克、胰腺手術(shù)、胰腺移植中,胰腺的缺血再灌注(I/R)損傷仍然是一個(gè)重要的臨床問題。損傷的主要機(jī)制是產(chǎn)生大量氧自由基和缺血性炎癥。許多研究表明,胰腺的I/R能增加血中白細(xì)胞數(shù),氧自由基的生產(chǎn),及細(xì)胞因子的釋放,從而引起急性胰腺炎及全身炎癥反應(yīng)綜合癥。
　　 在全身炎癥反應(yīng)綜合征中肺臟是首位受累的靶器官。因?yàn)?肺臟是唯一接受全部心臟排出量的器官,受循環(huán)中炎性細(xì)胞及介質(zhì)的損傷最大,隔離在肺部的活化炎性細(xì)胞和炎性胰腺釋放的蛋白酶都會(huì)

2、誘發(fā)急性肺損傷。急性胰腺炎是胰酶在胰腺內(nèi)被激活后引起胰腺組織自身消化的一種炎癥反應(yīng)性疾病,主要表現(xiàn)為血清淀粉酶和脂肪酶升高。急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷(acute pancreatitis-associated lunginjury,APALI)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,可通過某種機(jī)制導(dǎo)致胰腺酶的不適當(dāng)激活,這種機(jī)制包括酶解作用衍生的催化劑激活炎性細(xì)胞,白細(xì)胞的釋放,及氧化和亞硝化應(yīng)激的發(fā)生,從而改變氣道反應(yīng)性。
　　 目前研究認(rèn)為核因子κB(

3、nuclear factor-κB)在其中扮演重要角色,其活化被認(rèn)為是急性胰腺炎重要的早期事件。(NF-κB)是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,在細(xì)胞因子介導(dǎo)的感染、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增生、細(xì)胞凋亡等過程中起重要作用。正常生理情況下,NF-κB以無(wú)活性的形式存在于多種細(xì)胞的胞質(zhì)中,激活后促進(jìn)多種細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄,在炎癥反應(yīng)復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中,NF-κB的活化可能是一個(gè)中心環(huán)節(jié),研究表明NF-κB通過促進(jìn)TNF-α、IL-6、IL-8、細(xì)胞間

4、黏附分子(Intercellular adhesion molecular,ICAM)等基因的轉(zhuǎn)錄而參與肺損傷的發(fā)生,其中ICAM-1在胰腺炎引起的肺損傷中最受關(guān)注。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族成員,其在人體內(nèi)的分布十分廣泛,炎癥介質(zhì)能明顯上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞和其它非造血細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)。肺血管內(nèi)皮上表達(dá)的ICAM-1結(jié)合活化的白細(xì)胞表面的整合素CD11b/8β是白細(xì)胞的黏附、游走、聚集過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),其過度表達(dá)可以促進(jìn)局部炎性

5、反應(yīng)發(fā)生。
　　 巨噬細(xì)胞的作用越來越引起人們的重視。近年研究表明巨噬細(xì)胞活化可能是急性胰腺炎時(shí)發(fā)生肺損傷的的重要途徑之一[50]。活化的巨噬細(xì)胞可以釋放許多生物活性物質(zhì),如細(xì)胞因子、花生四烯酸等,均為前炎性反應(yīng)介質(zhì),可以介導(dǎo)PMN等釋放多種炎癥反應(yīng)介質(zhì)。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macro-phage migrationinhibitory facter,MIF)具有抑制巨噬細(xì)胞游走,促進(jìn)巨噬細(xì)胞的黏附和在炎癥局部浸潤(rùn)的作用,并可

6、刺激炎癥細(xì)胞分泌TNF、IL-1等促炎性細(xì)胞因子。巨噬細(xì)胞炎癥蛋-2(macrophage inflammatory protein 2,MIP-2)是大鼠ELR+(含谷-亮-精氨酸功能基序)CXC類趨化性細(xì)胞因子,在功能上和人類IL-8同源,是中性粒細(xì)胞的主要趨化細(xì)胞因子。本研究通過大鼠胰腺缺血再灌注模型,探討大鼠胰腺缺血再灌注時(shí),合并肺損傷、誘導(dǎo)氣道高反應(yīng)性中的作用；并探討NF-κB與ICAM-1mRNA表達(dá)及MIF與MIP-2在胰

7、腺缺血再灌注并發(fā)肺損傷中的作用。
　　 材料與方法：
　　 一、動(dòng)物模型和樣品制備
　　 1、I/R動(dòng)物模型
　　 通過阻斷胃十二指腸動(dòng)脈和脾動(dòng)脈2小時(shí),再灌注6小時(shí)誘導(dǎo)胰腺缺血。假手術(shù)組以相同的手術(shù)方法切開顯露胃十二指腸動(dòng)脈和脾動(dòng)脈,但不夾閉血管。
　　 2、試驗(yàn)取材
　　 取右股靜脈血作為血樣。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)向肺內(nèi)注入5ml生理鹽水,獲取肺灌洗液。Sham組沒有阻斷動(dòng)脈,其值作為未阻斷的基

8、礎(chǔ)對(duì)照值。切取肺組織,-80℃冷凍保存。
　　 二、觀察指標(biāo)及測(cè)定方法
　　 1、胰腺缺血再灌注誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性研究
　　 (1)收集血液樣本離心后,使用Kodak Ektachem DT60分析器(羅切斯特,紐約)測(cè)量血漿中分離的淀粉酶含量,以IU/L表示。
　　 (2)高效液相色譜法測(cè)量血液中源自一氧化氮(NO)的亞硝酸鹽和硝酸鹽陰離子
　　 (3)通過分光熒光計(jì)測(cè)量血液中甲基胍。
　

9、　 (4)白細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)量肺灌洗液標(biāo)本中的WBC。
　　 (5)通過酶聯(lián)免疫測(cè)定血液中腫瘤壞死因子(TNF-α)的表達(dá)量。按試劑盒說明書進(jìn)行操作。顯色后用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)450nm)比色讀數(shù),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出TNF-α數(shù)值。
　　 (6)全身體積描記法(Buxco co)測(cè)定氣道對(duì)乙酰甲膽堿的反應(yīng)變化。雙室體描儀由頭室和體室組成,各置一流量傳感器,分別用于測(cè)量鼻部呼吸引起的氣流變化和胸廓運(yùn)動(dòng)引起的氣流變化。流量傳感器感受到的

10、流量變化轉(zhuǎn)變成電信號(hào),經(jīng)放大器放大,轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)后,通過軟件(BioSystem XA software with NAManalyzer)分析,計(jì)算出大鼠氣道基線增強(qiáng)暫停系數(shù)(the baseline enhanced pause,Penh)。
　　 (7)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR采用mRNA分離試劑盒分離肺組織中的mRNA；使用ABI公司7000型檢測(cè)棱鏡(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)。通過實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定肺組織中的

11、iNOS的mRNA表達(dá)和腫瘤壞死因子(TNF-ακβ)的表達(dá)。
　　 2、NF-κB與ICAM-1在I/R并發(fā)肺損傷的作用研究
　　 (1)組織病理學(xué)評(píng)分:取各組大鼠胰頭部組織和右肺下葉組織經(jīng)4％多聚甲醛固定、石蠟包埋、HE染色,光鏡觀察組織病理學(xué)變化并進(jìn)行評(píng)分[29,30]。
　　 (2)收集血液樣本離心后,使用Kodak Ektachem DT60分析器(羅切斯特,紐約)測(cè)量血漿中分離的淀粉酶含量,以IU/L

12、表示。
　　 (3)肺組織MPO檢測(cè)按照試劑盒說明書操作。將肺組織機(jī)械勻漿后水浴、比色、參照如下公式計(jì)算:MPO(U/g)濕片=(測(cè)定管OD值-對(duì)照組OD值)/11.3×取樣量(g)。
　　 (4)Western Blot法檢測(cè)肺組織ICAM-1蛋白表達(dá),凝膠成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果照相及測(cè)定條帶的面積和灰度值,以目的條帶的面積×灰度值/Actin條帶的面積×灰度值的比值代表蛋白的表達(dá)水平。
　　 (5)NF-κB相對(duì)活性

13、檢測(cè):結(jié)果用Leica Q500Mc圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行密度分析,以灰度值表示NF-κB相對(duì)活性變化。
　　 3、I/R并發(fā)肺損傷中MIF與MIP-2的表達(dá)及意義研究
　　 (1)組織病理學(xué)評(píng)分:取各組大鼠胰頭部組織和右肺下葉組織經(jīng)4％多聚甲醛固定、石蠟包埋、HE染色,光鏡觀察組織病理學(xué)變化并進(jìn)行評(píng)分[29,30]。
　　 (2)收集血液樣本離心后,使用Kodak Ektachem DT60分析器(羅切斯特,紐約)測(cè)

14、量血漿中分離的淀粉酶含量,以IU/L表示。
　　 (3)肺組織MPO檢測(cè)按照試劑盒說明書操作。將肺組織機(jī)械勻漿后水浴、比色、參照如下公式計(jì)算:MPO(U/g)濕片=(測(cè)定管OD值-對(duì)照組OD值)/11.3×取樣量(g)。
　　 (4)RT-PCR法檢測(cè)肺組織MIF mRNA的表達(dá),采用Trizol一步法提取肺組織總RNA,紫外分光光度儀測(cè)定RNA濃度。用TC 21000數(shù)據(jù)圖像分析系統(tǒng)分析各條帶灰度值,得MIF/GADP

15、H的灰度比值,即為MIF mRNA的相對(duì)表達(dá)值。
　　 (5)肺組織MIP-2含量測(cè)定:肺組織用10倍體積的預(yù)冷勻漿介質(zhì)制成勻漿,一份用ELISA法檢測(cè)MIP-2濃度,采用ELISA全自動(dòng)檢測(cè)儀按rMIP-2/GRO-βELISA試劑盒供應(yīng)商提供的說明書設(shè)定反應(yīng)步驟；一份用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定蛋白含量。
　　 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)后,用均數(shù)(Mean

16、)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)描述正態(tài)分布數(shù)據(jù)的集中趨勢(shì)和離散水平。組間各檢測(cè)指標(biāo)比較采用r檢驗(yàn),試驗(yàn)前后比較采用配對(duì),檢驗(yàn),p值≤0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1、胰腺I/R誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)及肺內(nèi)白細(xì)胞(WBC)的增加。再灌注組中氣道的高反應(yīng)性可能是因?yàn)闅獾姥装Y,后者增加肺內(nèi)WBC的聚集及肺組織中iNOS的表達(dá)、腫瘤壞死因子、炎癥介質(zhì)的表達(dá)。
　　 2、胰腺缺血再灌注損傷可增高肺組織ICAM-1蛋白和IC