腎缺血再灌注損傷心內(nèi)氧化應激水平及細胞外超氧化物歧化酶的表達變化.pdf

1、腎缺血再灌注損傷（Renal ischemia reperfusion injury, RIRI)是臨床上腎臟手術治療時的一種病理現(xiàn)象。RIRI的發(fā)生可延遲術后患者腎臟功能的恢復，嚴重的可導致手術失敗以及腎功能衰竭。已有實驗研究證實：腎臟在血流被阻斷時會誘發(fā)不同部位的組織細胞損傷，當血液灌注恢復時會有大量活性氧族（reactive oxygen species：ROS)形成并從腎組織細胞釋放出來，進一步加重已有的細胞損傷，從而引發(fā)腎缺血

2、再灌注損傷的發(fā)生。因此，氧化應激被認為可能是導致RIRI發(fā)生的主要機制之一。
　　超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutases，SOD）有三種亞型，錳-超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、細胞外超氧化物歧化酶（extracellular SOD, EC-SOD)。 EC-SOD是清除細胞外ROS的SOD亞型。以往對于Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的抗氧化功能研究較多。但最近研究

3、發(fā)現(xiàn)：與Cu/Zn-SOD和Mn-SOD相比， EC-SOD可能在抗氧化應激和抗炎等方面發(fā)揮了更加重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)：心肌組織內(nèi)EC-SOD表達量的降低，可明顯增加患者高血壓和缺血性心肌疾病的發(fā)病率。EC-SOD與胞外基質(zhì)結合力下降，心血管和缺血性心臟疾病的發(fā)生風險也會明顯增加。此外，EC-SOD在心臟衰竭患者的表達水平也是明顯降低的。以上這些研究表明：EC-SOD在維持心肌正常功能中可能具有重要作用。
　　心臟是血液循環(huán)的動力

4、器官，為維持其正常功能需消耗大量的氧氣與營養(yǎng)物質(zhì)。因此，心臟對缺血缺氧反應十分敏感。當腎組織發(fā)生缺血再灌注損傷并處于氧化應激狀態(tài)時，心肌組織是否也會因氧化應激反應而誘發(fā)過氧化損傷？心肌EC-SOD的表達是否改變。
　　目的：探求RIRI后心肌組織EC-SOD基因和蛋白表達水平是否發(fā)生改變，這種改變與H2O2含量、MDA含量是否具有相關性。
　　方法：
　　1 RIRI動物模型的建立及檢測標本的處理
　　購于河北醫(yī)

5、科大學實驗動物中心的雄性Wister大鼠（體重200±10 g）12只，隨機分為對照組（Control組）和腎臟缺血再灌注損傷模型組(RIRI組)。按照余曉東等人的模型制備方法建立RIRI實驗動物模型：腹腔注射6％水合氯醛（5ml/kg）麻醉大鼠。將RIRI組大鼠固定于手術臺上，酒精消毒后開腹充分暴露雙側腎臟，先將大鼠的右側腎臟切除后,再鈍性地分離其左側腎動脈,并采用無創(chuàng)動脈夾于腎門內(nèi)側約0.5cm處夾閉左腎動脈，夾閉后腎臟顏色由鮮紅變

6、為淺紅，表明腎臟血液供應被阻斷成功。血液供應阻斷45分鐘后，松開動脈夾，可觀察到左側腎動脈迅速充盈,腎臟顏色也隨即由淺紅色轉(zhuǎn)變?yōu)轷r紅色,提示左側腎臟的血液重新灌注成功。Control組大鼠的消毒開腹過程與RIRI模型組一致，但該組大鼠雙側腎臟暴露后只切除其右側腎臟,鈍性地分離左側腎動脈,但并不夾閉阻斷血液灌注?；謴痛笫竽I臟血流灌注24小時后重新麻醉大鼠，收集右頸總動脈血液，離心后吸取上層血清，凍存后用于檢測肌酐（Serum Creati

7、nine，SCr）、尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）含量；先摘取大鼠腎臟，生理鹽水清洗后，固定于4%多聚甲醛溶液中，采用HE染色法觀察大鼠腎組織形態(tài)結構的變化。后摘取心臟，將切取的心臟迅速置于液氮中，待冷凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于檢測大鼠心肌組織EC-SOD基因和蛋白表達水平，以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）含量檢測。

8、r>　　2測定指標及檢測方法
　　2.1大鼠血清中SCr和BUN含量檢測
　　大鼠血清中SCr和BUN含量分別采用苦味酸和酶偶聯(lián)速率法測定。SCr和BUN含量的測定過程嚴格按照試劑盒操作說明進行。
　　2.2大鼠腎臟組織形態(tài)結構改變的觀察
　　采用HE染色法觀察腎臟組織形態(tài)結構的改變。將4%多聚甲醛固定的腎臟標本用梯度（50℅→100℅）乙醇進行脫水、兩道二甲苯進行透明，最后用熔化的石蠟進行浸蠟和包埋處理。將包埋

9、后的腎臟標本塊，修塊后切片，厚度約5μm，將切片撈于載玻片上，梯度（100℅→50℅）乙醇至水，然后進行蘇木精伊紅染色，染色、分色后梯度（50℅→100℅）乙醇進行脫水，二甲苯透明樹膠封片。Olympus光學顯微鏡觀察腎組織形態(tài)學改變并拍照。
　　2.3大鼠心肌組織中MDA含量檢測
　　按照10mg/100μl的比例向冰凍的心肌組織內(nèi)加入預冷的勻漿緩沖液。勻漿緩沖液構成：磷酸鉀50mmol/L，苯甲基磺酰氟1mmol/L，苯

10、甲脒1mmol/L，吐溫-200.1%，氯化鈉0.5mol/L，乙二胺三乙酸三鈉1mmol/L，β-巰基乙醇5mmol/L，PH7.4。冰水混合物容器內(nèi)勻漿，然后將勻漿液4℃、4000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，收集上清液即為10％大鼠心肌組織勻漿，其MDA含量采用巴比妥酸比色法檢測，整個檢測過程按照南京建成MDA測定試劑盒的操作指南進行。
　　2.4大鼠心肌中H2O2含量檢測
　　勻漿緩沖液構成：磷酸鉀50mmol/L，苯甲基磺

11、酰氟1mmol/L，苯甲脒1mmol/L，吐溫-200.1%，氯化鈉0.5mol/L,乙二胺三乙酸三鈉1mmol/L，β-巰基乙醇5mmol/L，PH7.4。向預冷的勻漿緩沖液中加入冰凍的心肌組織，使其濃度為10mg/100μl，冰水混合物容器內(nèi)勻漿，然后將勻漿液4℃、4000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，收集上清液，此時制成含大鼠心肌組織10％的勻漿液。心肌勻漿液內(nèi)H2O2含量采用鉬酸比色法測定，以每克心肌蛋白所含H2O2的量表示心肌組織中H2

12、O2的含量（mmol/g pro）。
　　2.5大鼠心肌組織EC-SOD基因水平表達檢測
　　采用TRIzol試劑裂解大鼠心肌組織提取其中的總RNA。RNA定量后，采用3μg RNA反轉(zhuǎn)錄成模板cDNA。選取磷酸甘油醛脫氫酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參照，進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳，拍照測量擴增產(chǎn)物條帶灰度值，采用EC-SO

13、D擴增產(chǎn)物與內(nèi)參照 GAPDH擴增產(chǎn)物的灰度值比，來表示EC-SOD基因的相對表達量。
　　2.6大鼠心肌組織EC-SOD蛋白水平表達檢測
　　采用Western blotting（免疫印跡法）測定大鼠心肌組織EC-SOD蛋白水平的相對表達量。冰水混合物容器內(nèi)將大鼠心肌組織勻漿,勻漿液離心（3000rpm），取上清、煮沸，使其蛋白變性，采用改良Lowry法進行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白上樣量為65 ug，轉(zhuǎn)膜后5％脫脂

14、奶粉封閉處理,將5％脫脂奶粉稀釋的兔抗EC-SOD抗體（一抗）滴加到PVDF膜上，將其置于搖床4℃震蕩過夜。經(jīng)Tween-TBS漂洗液洗膜兩次后，滴加熒光標記的二抗（抗兔IgG）。條帶選用雙色紅外線成像系統(tǒng)掃描并對其灰度值進行分析。
　　2.7大鼠心肌EC-SOD mRNA、蛋白表達水平與MDA含量、H2O2含量相關性分析
　　采用Pearson相關性統(tǒng)計法分析大鼠心肌EC-SOD mRNA、蛋白表達水平與MDA含量、H2O

15、2含量的相關性
　　結果：
　　1大鼠腎組織的HE觀察結果
　　HE法觀察大鼠腎組織形態(tài)結構改變。對照組大鼠腎組織光鏡下可見：腎小球、腎小囊形態(tài)正常未見血管球萎縮囊腔擴張，近、遠曲小管以及集合管的形態(tài)結構未見異常，腎間質(zhì)結構規(guī)整無異常。而RIRI組大鼠腎組織光鏡下可見：腎小體、腎小管之間的間隙擴大；腎血管球萎縮、體積縮?。荒I小囊的囊腔增寬變大；近、遠曲小管以及集合管的管壁細胞萎縮體積變小，管腔明顯擴張。心肌組織在光學顯

16、微鏡下兩組間未見明顯形態(tài)結構變化。
　　2大鼠血清SCr含量
　　腎缺血再灌注損傷組大鼠血清SCr含量為131.153±17.814μmol/L，正常對照組大鼠血清SCr含量為103.444±8.465μmol/L，兩組相比腎缺血再灌注損傷組大鼠血清SCr含量升高（P<0.05）。
　　3大鼠血清BUN含量
　　腎缺血再灌注損傷組大鼠血清BUN含量為13.685±4.397 mmol/L，正常對照組大鼠血清BUN

17、含量為4.462±0.541 mmol/L，兩組相比，腎缺血再灌注損傷組大鼠血清BUN含量升高明顯（P<0.05）。
　　4大鼠心肌組織中MDA含量
　　腎缺血再灌注損傷組大鼠心肌組織MDA含量為14.01±2.29 mmol/g，正常對照組大鼠心肌組織MDA含量為10.18±1.77mmol/g，兩組相比，腎缺血再灌注損傷組大鼠心肌組織MDA含量升高（P<0.01）。
　　5大鼠心肌組織中H2O2含量
　　腎缺

18、血再灌注損傷組大鼠心肌組織H2O2含量為18.56±2.56 mmol/g，正常對照組大鼠心肌組織H2O2含量為13.93±1.88 mmol/g，兩組相比，腎缺血再灌注損傷組大鼠心肌組織H2O2含量升高（P<0.01）。
　　6心肌組織EC-SOD基因的表達改變
　　RT-PCR法測定大鼠心肌組織EC-SOD的mRNA相對表達水平， GAPDH作為擴增內(nèi)對照。與對照組大鼠心肌組織EC-SOD mRNA表達量（0.73±0.

19、11）相比，腎缺血再灌注損傷組大鼠心肌組織EC-SOD mRNA表達水平（1.15±0.17）明顯升高，（P<0.01）。此結果表明：腎缺血再灌注損傷發(fā)生后，RIRI組大鼠心肌組織EC-SOD基因表達水平明顯增強。
　　7心肌組織EC-SOD的蛋白表達改變
　　免疫印跡法檢測蛋白水平EC-SOD相對表達量，腎缺血再灌注損傷組大鼠心肌組織EC-SOD蛋白相對表達量為1.07±0.12，正常對照組大鼠心肌組織EC-SOD蛋白相對

20、表達量為0.65±0.1，兩組相比，腎缺血再灌注損傷組大鼠心肌組織EC-SOD蛋白相對表達量增強（P<0.01）。此結果表明：腎缺血再灌注損傷發(fā)生后，RIRI組大鼠心肌組織EC-SOD的蛋白表達水平也是增強的。
　　8心肌EC-SOD mRNA、蛋白表達水平與MDA、H2O2含量的相關性
　　Pearson統(tǒng)計法分析大鼠心肌EC-SOD mRNA、蛋白表達水平與MDA含量、H2O2含量的相關性。心肌EC-SOD mRNA表達