整合素β4對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞免疫信號(hào)傳遞的影響.pdf

1、氣道上皮作為溝通機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的第一道屏障，除發(fā)揮物理性防御作用，更具有豐富的生物學(xué)功能，在氣道局部微環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮重要作用。越來(lái)越多研究認(rèn)識(shí)到，氣道上皮的結(jié)構(gòu)完整性缺陷或功能紊亂可能是哮喘和慢性阻塞性肺疾病等氣道高反應(yīng)性疾病的啟動(dòng)環(huán)節(jié)。哮喘在本質(zhì)上被公認(rèn)為慢性炎癥性疾病，而Th1/Th2免疫應(yīng)答失衡學(xué)說(shuō)在哮喘眾多發(fā)病機(jī)制中一直占據(jù)主流地位。氣道上皮細(xì)胞具有抗原呈遞細(xì)胞的特性，對(duì)外表達(dá)TOLL樣受體(Toll likereceptor

2、s，TLRs)模式識(shí)別捕獲外來(lái)病原菌，對(duì)內(nèi)通過(guò)協(xié)同刺激分子B7家族將免疫信號(hào)傳遞給T細(xì)胞。這在一定程度上影響T細(xì)胞免疫平衡和氣道局部的免疫狀態(tài)。整合素β4(integrinβ4)作為形成半橋粒結(jié)構(gòu)的中心組份，介導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞與基底膜的牢固粘附，其正常表達(dá)是維持氣道上皮細(xì)胞“錨著依賴(lài)性”生長(zhǎng)的重要基礎(chǔ)。哮喘患者氣道粘膜鏡檢常有上皮脫落、凋亡。本課題組前期工作已經(jīng)證實(shí)哮喘病人外周血和氣道粘膜integrinβ4的表達(dá)均低于健康人群，且int

3、egrinβ4在氣道上皮細(xì)胞具有促增殖、抑凋亡、抗氧化損傷、減少免疫原卵白蛋白(ovalbumin，OVA)攝取等保護(hù)性作用。據(jù)此我們假設(shè):integrinβ4表達(dá)缺陷可能是引起氣道上皮結(jié)構(gòu)和功能失穩(wěn)態(tài)進(jìn)而提高哮喘易感性最終導(dǎo)致發(fā)病的關(guān)鍵因素。那么，integrinβ4是否也能影響氣道上皮細(xì)胞本身免疫狀態(tài)從而調(diào)節(jié)氣道局部的免疫應(yīng)答？本研究擬合成integrinβ4的特異性小干擾RNA(siRNA)片段，在人支氣管上皮細(xì)胞(human b

4、ronchial epithelial cells，HBECs)中沉默integrinβ4基因表達(dá)，觀察其對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞B7分子家族譜、抗原OVA攝取后TLR4的表達(dá)的改變，以及對(duì)共培養(yǎng)的人淋巴細(xì)胞增殖的影響。以拓寬對(duì)integrinβ4生理功能的認(rèn)識(shí)，進(jìn)一步闡明哮喘發(fā)病機(jī)制。本研究分為四個(gè)部分：
　　 第一部分：合成特異性integrinβ4 siRNA并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HBECs。
　　 目的：利用siRNA技術(shù)抑制i

5、ntegrinβ4在HBECs中的表達(dá)
　　 方法：化學(xué)合成integrinβ4 siRNA片段，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人支氣管上皮細(xì)胞株，采用real-time PCR和Western-blotting驗(yàn)證沉默效率。
　　 結(jié)果：real-time PCR和Western-blotting結(jié)果顯示，siRNA片段轉(zhuǎn)染后氣道上皮integrinβ4表達(dá)顯著下降。
　　 結(jié)論：篩選的integrinβ4 siRNA片段可高效

6、沉默人支氣管上皮細(xì)胞株integrinβ4基因表達(dá)。
　　 第二部分：Integrinβ4基因沉默對(duì)支氣管上皮細(xì)胞B7H1及B7DC表達(dá)的影響。
　　 目的：觀察integrinβ4基因沉默后HBECs共刺激分子B7家族B7H1和B7DC的改變。
　　 方法：運(yùn)用real-time PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)integrinβ4沉默組和對(duì)照組B7H1和B7DC的mRNA水平及蛋白水平的改變。
　　 結(jié)果：re

7、al-time PCR結(jié)果顯示，B7H1和B7DCmRNA在integrinβ4沉默后表達(dá)明顯上調(diào)，流式細(xì)胞術(shù)在蛋白水平的檢測(cè)也表現(xiàn)出一致的趨勢(shì)。
　　 結(jié)論：integrinβ4沉默促進(jìn)人支氣管上皮細(xì)胞株B7H1、B7DC的表達(dá)。
　　 第三部分：Integrinβ4基因沉默對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞TLR4基因表達(dá)的影響。
　　 目的：觀察siRNA靶向沉默integrinβ4對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞TLR4基因表達(dá)的影響

8、。
　　 方法：免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(ICC)觀察integrinβ4沉默的HBECs經(jīng)OVA刺激后TLR4基因表達(dá)的改變。
　　 結(jié)果：siRNA轉(zhuǎn)染48 h可顯著抑制HBECs中integrinβ4的蛋白表達(dá);與對(duì)照組相比，經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染的人支氣管上皮細(xì)胞株在OVA刺激1h后，TLR4表達(dá)明顯上調(diào)。
　　 結(jié)論：siRNA可高效沉默人支氣管上皮細(xì)胞株integrinβ4，顯著上調(diào)OVA刺激后TLR4的表達(dá)。

9、r>　　 第四部分：Integrinβ4基因沉默對(duì)與HBECs共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞增殖的作用。
　　 目的：觀察integrinβ4基因沉默是否影響與HBECs共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞的增殖。
　　 方法：建立integrinβ4基因沉默的HBECs與新鮮人血分離的淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系，MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖。
　　 結(jié)果：OVA刺激促進(jìn)與HBECs共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞增殖，integrinβ4 siRNA可在一定程度上抑制這