RSV感染支氣管上皮細胞致Th細胞亞群漂移作用研究.pdf

1、目的：
　　 免疫異常激活和免疫失衡是哮喘等氣道高反應(yīng)性疾病發(fā)生和持續(xù)存在的主要免疫學(xué)基礎(chǔ)。外源性抗原通過抗原提呈細胞激活淋巴細胞，誘導(dǎo)T淋巴細胞增殖和分化，激活免疫反應(yīng)。由于輔助性T淋巴細胞(Th細胞)亞群異常漂移使免疫細胞因子過高表達，導(dǎo)致哮喘發(fā)病。近年來認為氣道上皮在氣道高反應(yīng)的免疫失衡機制中可能發(fā)生作用。氣道上皮不再被僅僅看作為單純的機械屏障，而是機體內(nèi)環(huán)境與外部環(huán)境相互作用的界面，參與氣道局部微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持和調(diào)節(jié)。已

2、知氣道上皮具有分泌炎性因子、趨化免疫細胞以及抗原提呈等功能，其結(jié)構(gòu)和功能的異常將導(dǎo)致哮喘易感性增加，有可能成為哮喘發(fā)病的啟動環(huán)節(jié)。
　　 呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial viruses，RSV)是引起嬰幼兒和成人毛細支氣管炎和肺炎的主要病原體。臨床流行病學(xué)證據(jù)顯示，RSV感染可使哮喘發(fā)生的危險性顯著增加，但其具體機制尚不清楚。本研究假設(shè)，由于RSV的嗜上皮特性，其進入機體后首先感染氣道上皮組織，改變了

3、氣道上皮細胞的免疫調(diào)控方式，誘導(dǎo)機體免疫異常激活和免疫失衡，包括氣道上皮細胞的分泌模式轉(zhuǎn)變、過度釋放炎性介質(zhì)，從而導(dǎo)致Th細胞亞群異常漂移，形成哮喘的免疫易感體質(zhì)。為求證這一學(xué)術(shù)思想，本研究擬建立人支氣管上皮細胞(HBECs)持續(xù)感染RSV模型，觀察外周血淋巴細胞被該模型激活后Th亞群的漂移及淋巴細胞因子的釋放情況，以證實HBECs持續(xù)感染RSV后改變免疫平衡狀態(tài)，進而探討其分子機制，篩選并證實分子靶點。研究內(nèi)容展開如下：
　　

4、 (1)建立人支氣管上皮細胞(HBECs)持續(xù)感染RSV模型，觀察該模型對淋巴細胞的活化作用以及Th細胞亞群分布的影響；
　　 (2)分別制備正常HBECs和持續(xù)感染RSV的HBECs的基因芯片，觀察其mRNA的差異表達，并篩選出編碼分泌蛋白的差異基因；
　　 (3)驗證明顯上調(diào)的編碼分泌蛋白的差異基因，觀察該基因編碼的分泌蛋白對Th亞群分化的調(diào)控功能并初步探討其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。
　　 方法與結(jié)果：
　　

5、1.RSV感染人支氣管上皮細胞(HBECs)對淋巴細胞的活化作用。
　　 1)構(gòu)建RSV持續(xù)感染HBECs模型；
　　 用TCID50法測定RSV毒株的毒力為1.4×106pfu/mL，設(shè)定感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.0001，構(gòu)建RSV持續(xù)感染HBECs模型。該模型具有以下典型特征：①感染細胞仍能夠繼續(xù)分裂傳代；②傳代后的感染細胞內(nèi)可檢測到RSV持續(xù)存在的證據(jù)。光鏡下可見部分感染細胞晚期出現(xiàn)融合病變；免疫熒光顯示細胞內(nèi)有R

6、SV致病蛋白的熒光表達；電鏡下感染細胞的線粒體水腫，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，出現(xiàn)核周裂隙，胞漿內(nèi)有大量的溶酶體，胞核、胞漿內(nèi)均有病毒顆粒分布。
　　 2)HBECs持續(xù)感染RSV后對淋巴細胞的活化作用；
　　 體外分離外周血淋巴細胞，將其分為淋巴細胞組(L組)、RSV作用于淋巴細胞組(RL組)、正常HBECs與淋巴細胞共培養(yǎng)組(HL組)、RSV持續(xù)感染HBECs與淋巴細胞共培養(yǎng)組(HRL組)，24小時后分別收獲各組淋巴細胞和上清液。

7、PI染色、流式細胞技術(shù)測定淋巴細胞的凋亡率和細胞周期，結(jié)果顯示HRL組的S期(有絲分裂期)的細胞比例和凋亡率在四組中均最高，其次是HL組的S期細胞比例也高于L組和RL組。此項數(shù)據(jù)說明感染RSV后的HBECs可誘導(dǎo)淋巴細胞顯著增殖，同時又加速淋巴細胞的凋亡。正常HBECs也可刺激淋巴細胞在一定程度上增殖。單獨RSV對淋巴細胞的增殖和凋亡無明顯作用。ELISA法檢測上清液中淋巴細胞因子IL-4，IFN-γ和IL-17的水平，發(fā)現(xiàn)RSV持續(xù)感

8、染HBECs可促使淋巴細胞大量分泌IL-4、IFN-γ和IL-17等細胞因子，正常HBECs可刺激淋巴細胞分泌一定量的IFN-γ，單獨RSV對淋巴細胞無明顯激活作用。
　　 3)RSV感染HBECs的上清液調(diào)控Th亞群的分化；
　　 我們將細胞培養(yǎng)液、正常HBECs的上清液以及RSV持續(xù)感染HBECs的上清液分別作用于淋巴細胞24小時，免疫熒光染色后流式細胞儀測定淋巴細胞中Th2、Th17以及Treg亞群的分布。結(jié)果顯示

9、感染RSV的HBECs上清液可促進Th2和Th17的分化并且抑制Treg的分化，正常HBECs也可一定程度上促進Th2和Th17亞群的分化。
　　 第一部分結(jié)果說明RSV感染HBECs可促進淋巴細胞增殖、凋亡，淋巴細胞因子的釋放和Th亞群異常漂移，對淋巴細胞具有活化作用。
　　 2.人支氣管上皮細胞(HBECs)感染RSV后的差異基因表達。
　　 制備正常HBECs和持續(xù)感染RSV的HBECs的mRNA基因芯片，

10、進行基因表達譜差異分析，篩選出HBECs持續(xù)感染RSV后的差異表達基因?；蛐酒Y(jié)果顯示，相對于正常HBECs，感染RSV的HBECs內(nèi)有349個基因表達上調(diào)，154個基因表達下調(diào)。差異基因中，有12個基因編碼分泌蛋白，其中3個基因表達下調(diào)，9個基因表達上調(diào)。分泌譜中，CYR61基因是顯著下調(diào)表達(ratio<0.2)，GVIN1、LEP和IL8基因是顯著上調(diào)表達(ratio>5)。
　　 第二部分結(jié)果提示RSV持續(xù)感染HBEC

11、s后其mRNA表達明顯改變，從而引起支氣管上皮細胞的局部微環(huán)境發(fā)生變化。
　　 3.白介素8(IL-8)和瘦素(leptin)介導(dǎo)人支氣管上皮細胞(HBECs)感染RSV后致Th亞群漂移作用
　　 根據(jù)之前基因芯片的結(jié)果測得感染RSV后的HBECs中有12個編碼分泌蛋白的基因呈現(xiàn)差異表達，其中上調(diào)水平最高的兩個基因分別足IL8和LEP，它們編碼的蛋白分別是白介素8(IL-8)和瘦素(leptin)。熒光定量PCR檢測IL

12、-8和瘦素mRNA的表達，結(jié)果與基因芯片一致，即HBECs在持續(xù)感染RSV后，其細胞內(nèi)IL-8和瘦素mRNA的表達相對于正常HBECs顯著上調(diào)。ELISA檢測正常HBECs和RSV持續(xù)感染HBECs的細胞上清液中IL-8和瘦素的水平。結(jié)果顯示RSV感染組的IL-8和瘦素的水平明顯高于對照組，說明HBECs持續(xù)感染RSV后過度分泌IL-8和瘦素等細胞因子。
　　 參照ELISA檢測所得的感染RSV的HBECs的細胞上清液中IL-8

13、和瘦素的平均濃度，我們將重組人IL-8和瘦素作用于外周血淋巴細胞，24小時后流式細胞儀檢測淋巴細胞中Th2、Th17和Treg亞群的分布情況。結(jié)果顯示IL-8和瘦素都可促進Th2和Th17亞群的分化，尤其是瘦素。不僅如此，IL-8與瘦素具有協(xié)同作用，共同使Th2的分化愈加增強。而IL-8和瘦素對Treg的分化均無影響。Western blotting和免疫熒光檢測淋巴細胞中細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)的表達及其磷酸化水平。結(jié)

14、果顯示，IL-8和瘦素都可以促進ERK1/2的磷酸化。
　　 第三部分結(jié)果說明HBECs感染RSV后能夠過度分泌IL-8和瘦素，而IL-8和瘦素可能是通過活化ERK1/2信號分子來促進Th2和Th17細胞亞群的分化。
　　 結(jié)論：
　　 人支氣管上皮細胞(HBECs)持續(xù)感染RSV后活化外周血淋巴細胞，引起Th亞群異常漂移。同時，HBECs感染RSV后過度分泌的IL-8和瘦素可能通過活化ERK1/2信號分子在引起