MAPK-線粒體凋亡途徑在綿羊肺炎支原體致支氣管上皮細(xì)胞氧化損傷中的作用機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　綿羊肺炎支原體(Mycoplasma.ovipneumoniae，簡(jiǎn)稱MO)是一種可感染綿羊和山羊，引起羊支原體肺炎的病原菌。綿羊肺炎支原體的主要宿主細(xì)胞是綿羊支氣管上皮細(xì)胞，其在感染宿主細(xì)胞的過程中會(huì)造成宿主細(xì)胞損傷;近年來研究發(fā)現(xiàn)，綿羊肺炎支原體可以通過自身代謝掠奪養(yǎng)分產(chǎn)生H2O2，導(dǎo)致活性氧(ROS)的積累。線粒體作為細(xì)胞呼吸作用的重要細(xì)胞器，對(duì)ROS較為敏感，ROS的沉積會(huì)造成線粒體的損傷，線粒體損傷又可以進(jìn)一

2、步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;并且，ROS還是絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)途徑的激活劑，MAPK信號(hào)途徑的主要作用是將信號(hào)從細(xì)胞外傳至細(xì)胞內(nèi)的各種細(xì)胞器。然而，綿羊肺炎支原體產(chǎn)生的ROS是否能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，以及其是否經(jīng)MAPK和/或線粒體凋亡途徑造成宿主細(xì)胞損傷尚不可知。
　　方法與內(nèi)容:
　　本研究采用綿羊支氣管上皮細(xì)胞的氣液相界面培養(yǎng)(Air-Liquid Interface，ALI)模型，通過DCFH-DA及J

3、C-1探針裝載、WST-8、Western Blot、AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)、Tunel原位末端凋亡檢測(cè)等方法開展了以下研究:1.通過檢測(cè)綿羊肺炎支原體感染支氣管上皮細(xì)胞后產(chǎn)生ROS、丙二醛(MDA)、GSH/GSSG的水平，抗氧化物酶活性以及線粒體膜電位變化，以探討該病原菌是否誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng);2.在綿羊肺炎支原體感染宿主細(xì)胞后不同時(shí)間，移除培養(yǎng)體系中的病原體，繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間，檢測(cè)細(xì)胞中的RO

4、S含量，以探討導(dǎo)致宿主細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激的ROS的效應(yīng)模式;3.用綿羊肺炎支原體感染經(jīng)ROS清除劑NAC和線粒體靶向抗氧化劑MiTo-TEMPO處理和未處理的宿主細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中ROS、線粒體膜電位、細(xì)胞凋亡以及MAPK和線粒體信號(hào)途徑中相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化，以探討該病原菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS是否經(jīng)MAPK/線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡;4.用綿羊肺炎支原體感染經(jīng)ERK抑制劑(PD032590)、JNK抑制劑(SP600125)和P38 M

5、APK抑制劑(SB203580)處理和未處理的宿主細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中ROS、線粒體膜電位、細(xì)胞凋亡以及線粒體信號(hào)途徑中相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化，以探討該病原菌經(jīng)MAPK途徑誘導(dǎo)宿主細(xì)胞線粒體損傷的機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.綿羊肺炎支原體感染支氣管上皮細(xì)胞產(chǎn)生ROS，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致線粒體的損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這一過程伴隨著細(xì)胞內(nèi)MDA、GSSG水平的增加和抗氧化蛋白酶CAT、GSS、T-SOD、Mn-SOD表達(dá)水平及G

6、SH活性水平的降低。
　　2.綿羊肺炎支原體感染支氣管上皮細(xì)胞不同時(shí)間后，清除培養(yǎng)體系中的病原體后繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞中的ROS含量在較長(zhǎng)時(shí)間保持較高水平。提示，綿羊肺炎支原體的一過性感染對(duì)支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)具有明顯的觸發(fā)效應(yīng)。
　　3.綿羊肺炎支原體感染產(chǎn)生的ROS激活細(xì)胞中ERK、JNK和p38 MAPK信號(hào)介導(dǎo)的MAPK信號(hào)途徑，抑制BCL-2抗凋亡蛋白的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體損傷并釋放細(xì)胞色素C(Cyt-C)進(jìn)

7、入細(xì)胞質(zhì)，啟動(dòng)caspases信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　4.綿羊肺炎支原體感染經(jīng)線粒體靶向抗氧化劑MiTo-TEMPO預(yù)處理的支氣管上皮細(xì)胞后，宿主細(xì)胞中ERK、JNK和P38MAPK信號(hào)介導(dǎo)的MAPK信號(hào)途徑中的MEK、ERK、p90RSK、JNK1/2、AP-1、TAK1、MKK3/6和P38 MAPK等關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平顯著降低(P＜0.05、P＜0.01)，表明綿羊肺炎支原體誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞產(chǎn)生的R

8、OS對(duì)ERK、JNK和P38MAPK信號(hào)介導(dǎo)的MAPK信號(hào)途徑具有正反饋?zhàn)饔谩?br>　　結(jié)論:
　　本研究利用綿羊支氣管上皮細(xì)胞ALI界面培養(yǎng)模型探討了綿羊肺炎支原體感染支氣管上皮細(xì)胞過程中誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的潛在作用機(jī)理。研究結(jié)果表明，綿羊肺炎支原體感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生的ROS通過增加支氣管上皮細(xì)胞的脂類過氧化物、降低細(xì)胞抗氧化物的水平等途徑誘發(fā)宿主細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活宿主細(xì)胞的MAPK信號(hào)途徑，改變BCL-2家族蛋白水平的