線粒體途徑在葛根素拮抗鉛誘導(dǎo)原代大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、鉛是環(huán)境中一種常見的重金屬污染物。我國(guó)工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的快速發(fā)展使生態(tài)環(huán)境受到鉛的廣泛性污染，進(jìn)入生態(tài)環(huán)境中的鉛不能進(jìn)行生物降解，可通過多種方式進(jìn)入機(jī)體并對(duì)機(jī)體造成損傷。同時(shí)，鉛為慢性蓄積性毒物，低劑量持續(xù)進(jìn)入機(jī)體能逐漸蓄積而呈現(xiàn)毒害作用，鉛對(duì)機(jī)體的損傷呈多系統(tǒng)和多器官，可引起肝臟、心臟、腎臟、大腦等器官毒性。腎臟是鉛毒性作用的重要靶器官之一，腎小管是鉛腎毒性的靶部位。葛根素（PU）是從葛根中提取并分離出的一種中藥單體，屬于異黃酮類提取物。很

2、多研究發(fā)現(xiàn)葛根素具有抗菌、消炎、提高機(jī)體免疫力的功效；同時(shí)，葛根素是一種有效的天然自由基清除劑，對(duì)DNA損傷有明顯的保護(hù)作用，可防止組織的過氧化應(yīng)激損傷；除此之外，一些研究還發(fā)現(xiàn)葛根素具有減緩腎毒素所致腎損傷的功效。前期研究證實(shí)細(xì)胞凋亡在低劑量鉛誘導(dǎo)SD大鼠腎小管上皮細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮主導(dǎo)作用。線粒體作為內(nèi)源性通路的中心環(huán)節(jié)參與調(diào)控細(xì)胞凋亡，在線粒體凋亡途徑中占有非常重要的地位。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)葛根素對(duì)鉛所致腎毒性有顯著保護(hù)效應(yīng)，但葛根素

3、是否通過線粒體途徑進(jìn)行拮抗鉛誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡起保護(hù)效應(yīng)尚不明確。本實(shí)驗(yàn)以原代培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞為模型，進(jìn)行鉛染毒及葛根素共孵育處理12h。通過檢測(cè)細(xì)胞存活率來篩選葛根素的最佳保護(hù)濃度，通過相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平及比色法檢測(cè)丙二醛（MDA）含量來驗(yàn)證所篩選最佳濃度的葛根素對(duì)鉛所致細(xì)胞毒性的保護(hù)效應(yīng)。采用激光共聚焦顯微技術(shù)檢測(cè)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）的開放程度，免疫

4、印跡技術(shù)（Western Blot）分析凋亡因子細(xì)胞色素c（Cyt-c）的釋放和凋亡關(guān)鍵酶caspase-9、caspase-3、PARP的表達(dá)。同時(shí)，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)胞內(nèi)ATP含量，并分析ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)和線粒體形態(tài)學(xué)變化。此外，檢測(cè)了Bcl-2及Bax基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平。結(jié)果表明：葛根素濃度在100μM時(shí)對(duì)鉛毒性所致的腎小管上皮細(xì)胞損傷表現(xiàn)出顯著的保護(hù)效應(yīng)，可使細(xì)胞凋亡率下降、細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)以及細(xì)胞內(nèi)活性氧和丙二醛含量維持在

5、機(jī)體正常水平；與此同時(shí)，葛根素可以有效地抑制由于MPTP過度開放導(dǎo)致的凋亡因子Cyt-c的釋放，Caspase-9和Caspase-3的激活，以及聚ADP-核糖多聚酶（PARP）的切割；通過提高線粒體膜電位以及調(diào)控ANT-1和ANT-2蛋白的表達(dá)兩種方式減緩鉛毒性導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP的損耗；此外，葛根素處理之后Bcl-2上調(diào)以及Bax下調(diào)能進(jìn)一步減輕鉛誘導(dǎo)的線粒體損傷?？傊?，葛根素可通過抑制線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換阻止凋亡因子釋放和凋亡酶激活來拮