Intermedin對缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)的大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：以大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)缺氧復(fù)氧(H/R)模型模擬在體缺血再灌注(I/R)損傷，通過轉(zhuǎn)染高表達(dá)IMD質(zhì)粒，探討中介素(IMD)對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)凋亡的影響及機制。
　　 方法：(1)利用三氣培養(yǎng)箱調(diào)整氮氣壓力形成缺氧條件，缺氧4h，復(fù)氧12h后檢測NRK-52E活細(xì)胞計數(shù)、細(xì)胞存活率和培養(yǎng)液上清乳酸脫氫酶(LDH)判斷模型制備成功與否。(2)利用Fugene HD轉(zhuǎn)染

2、試劑，將pIRES2-EGFP/IMD表達(dá)質(zhì)粒和pIRES2-EGFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至NRK-52E細(xì)胞內(nèi)，于倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率，選定最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件；選轉(zhuǎn)染效率高的細(xì)胞用含G418300μg/ml的10％胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，2周后獲得穩(wěn)定表達(dá)IMD的陽性克隆NRK-52E細(xì)胞。(3)實驗分對照組，模型組，空質(zhì)粒組和IMD質(zhì)粒組共四組，后三組行H/R實驗，留取細(xì)胞上清液及細(xì)胞，分別以流式細(xì)胞儀測細(xì)胞

3、凋亡率，酶聯(lián)免疫法測絲氨酸-蘇氨酸激酶(Akt)活性，比色法測Caspase-3活性。
　　 結(jié)果：(1)經(jīng)缺氧4h，復(fù)氧12h后，NRK-52E細(xì)胞計數(shù)量降低，細(xì)胞存活率下降，細(xì)胞上清液中LDH含量顯著增加，造模成功。(2)于熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察轉(zhuǎn)染率，結(jié)果顯示質(zhì)粒3μg：FuGENE HD12μl的比例轉(zhuǎn)染在48h的轉(zhuǎn)染效率最高；G418篩選第3天起轉(zhuǎn)染陽性的細(xì)胞逐漸出現(xiàn)克隆樣增殖，第5天起未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞出現(xiàn)批量死亡，以

4、后陽性細(xì)胞克隆逐漸增加，2周后可見融合成片狀的陽性克隆細(xì)胞。(3)細(xì)胞上清液磷酸化絲氨酸-蘇氨酸激酶(p-Akt)含量，與對照組相比，H/R后各組細(xì)胞Akt磷酸化水平增高，其中IMD質(zhì)粒組分別與模型組和空質(zhì)粒組相比，Akt磷酸化水平明顯增高，模型組和空質(zhì)粒組相比無明顯差別。(4)細(xì)胞Caspase-3活性，與對照組相比，H/R后各組細(xì)胞Caspase-3活性增強，其中IMD質(zhì)粒組分別與模型組和空質(zhì)粒組相比，Caspase-3活性明顯降低