胞內(nèi)鈣重分布在鎘所誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡與自噬中的作用.pdf

1、鎘是環(huán)境中一種常見的重金屬污染物，對(duì)機(jī)體的損傷呈多系統(tǒng)性和多器官性。腎臟是鎘毒性損傷的重要靶器官，而腎小管是鎘腎毒性損傷的靶部位。前期研究表明，氧化應(yīng)激所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在鎘染毒所致原代大鼠腎小管上皮細(xì)胞毒性損傷中發(fā)揮主導(dǎo)作用，且該過程中伴隨著胞漿鈣超載。鈣離子（Ca2+）作為一種重要的胞內(nèi)第二信使，對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬具有重要的調(diào)控作用。然而，鎘暴露所致胞漿鈣超載的來源、Ca2+對(duì)鎘所誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡及細(xì)胞自噬的調(diào)控作用尚未見報(bào)道

2、。鑒于此，本論文重點(diǎn)研究胞內(nèi)鈣重分布在鎘所誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡與自噬中的作用，為鎘的腎毒性機(jī)制研究提供重要的理論依據(jù)。
　　首先，對(duì)鎘誘導(dǎo)胞漿鈣超載的來源進(jìn)行了探究。在本實(shí)驗(yàn)中，用胞漿Ca2+特異性探針Fluo-4-AM，線粒體Ca2+特異性探針dihydro-Rhod-2-AM和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+特異性探針Mag-Fluo-4-AM分別檢測胞漿、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+水平。通過rPT細(xì)胞在含鈣和無鈣兩種培養(yǎng)體系中進(jìn)行不同時(shí)間的

3、鎘暴露，對(duì)胞漿鈣濃度的變化進(jìn)行檢測。接著檢測了鎘暴露對(duì)胞漿、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+水平的影響。隨后鎘與2-APB共孵育12 h，檢測2-APB對(duì)鎘誘導(dǎo)的胞內(nèi)鈣重分布的影響。最后采用放射免疫分析法和免疫印跡法分別檢測鎘染毒對(duì)IP3含量和IP3R（IP3R-1與IP3R-2）蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明鎘暴露導(dǎo)致胞內(nèi)鈣重分布，且IP3-IP3R通路激活導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放是胞漿鈣超載的主要來源。
　　其次，探討了鎘誘導(dǎo)的胞漿鈣超載對(duì)細(xì)

4、胞凋亡的調(diào)節(jié)作用。用TG、BAPTA-AM及2-APB對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，對(duì)胞漿鈣超載與細(xì)胞凋亡的關(guān)系進(jìn)行研究。首先通過Hoechst33258染色來觀察細(xì)胞核凋亡的形態(tài)變化，同時(shí)用細(xì)胞流式技術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡率進(jìn)行檢測，最后通過CCK-8檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果表明鎘誘導(dǎo)的胞漿鈣超載可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞毒性。
　　再次，對(duì)鎘誘導(dǎo)的胞漿鈣超載與細(xì)胞自噬的關(guān)系展開研究。首先對(duì)LC3、p62的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，接著使用RFP-GFP-LC

5、3與GFP-LC3對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，觀察鎘誘導(dǎo)的胞漿鈣超載對(duì)自噬流以及自噬小體數(shù)量的影響。結(jié)果表明在鎘處理的腎小管上皮細(xì)胞中，胞漿鈣超載抑制自噬流并且阻礙自噬小體的降解。隨后，采用免疫熒光技術(shù)對(duì)LC3與LAMP-1及LC3與Rab7的共定位情況進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示鎘誘導(dǎo)的胞漿鈣超載可阻礙自噬小體與溶酶體的融合，主要原因是Rab7對(duì)自噬小體的載運(yùn)功能失效。
　　最后，對(duì)氧化應(yīng)激與自噬之間的聯(lián)系展開了研究。首先用三種胞漿鈣調(diào)控劑對(duì)胞漿鈣超

6、載與氧化應(yīng)激之間的聯(lián)系進(jìn)行了檢測。隨后采用ROS清除劑NAC對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。先對(duì)LC3和P62蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析。再采用免疫熒光技術(shù)對(duì)LC3與LAMP1及LC3與Rab7進(jìn)行共定位分析。結(jié)果表明在鎘處理的大鼠腎小管上皮細(xì)胞中，胞漿鈣超載促進(jìn)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，且氧化應(yīng)激參與鎘誘導(dǎo)的自噬流損傷。
　　綜上所述，鎘暴露導(dǎo)致胞內(nèi)鈣重分布，即胞漿鈣超載同時(shí)伴隨線粒體鈣超載與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣外流；IP3激活的IP3R通路導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放是胞漿鈣超載